摘要：目的 探讨RNAi技术体外联合抑制MDR1和MRP1基因逆转肝细胞癌多药耐药的效果.方法 建立肝细胞癌多药耐药细胞株,分别构建MDR1和MRP1基因的shRNA的质粒载体,转染肝细胞癌多药耐药细胞株.设空白对照组、MDR1单基因抑制HepG2/MDR-1-si组、单基因抑制HepG2/MRP-1-si组、联合基因抑制HepG2/mm-si组.流式细胞术检测细胞周期及凋亡,MTT法检测转染后细胞耐药性,CCK-8试剂盒检测细胞活性及相对增值情况,caspase-3活性检测用分光光度仪,实时PCR测定MDR1/mRNA、MRP1/mRNA.结果 成功构建pSUPER-HepG2/MDR-1-si、pSUPER-HepG2/***-1-mRNA在HepG2/mm-si组与针对该基因设计的单基因沉默组（HepG2/MRP-1-si）的表达差异无统计学意义（P＞0.05）;在HepG2/mm-si组与HepG2/MDR-1-si）组的表达差异亦无统计学意义（P＞0.05）.HepG2/mm-si组Caspase-3活性明显高于HepG2/MRP-1-si,差异有统计学意义（14 623.7±338.9比13 215.7 ±90.6,P ＜0.05）.CCK-8法检测显示双基因沉默组的细胞活性、细胞数目与其他各组比较明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）.对照组HepG2/MDR-1-si、HepG2/MRP-1-si的耐药性分别为HepG2/mm-si组的1.39倍和1.58倍.HepG2/mm-si组耐药细胞株凋亡期细胞数量明显少于HepG2/MRP-1-si和HepG2/MDR-1-si组,差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 siRNA体外联合抑制MDR1和MRP1基因可以显著逆转肝细胞癌多药耐药.

摘要：目的构建短发夹RNA（shRNA）／mdr1的质粒表达载体并验证其体外表达效率。方法按照pSUPER的设计要求合成mdr1基因RNAi靶序列的64bp寡核苷酸序列，退火后双酶切法（BglⅡ和HindⅢ）克隆，得到质粒pSUPER-shRNA／mdr1，转染感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆，测序证实后扩增培养并提取，然后转染融合达90％以上的HepG2／mdr1细胞，阴性载体为对照组，实时聚合酶链反应（Real-timePCR）、流式细胞术检测mdr1基因mRNA、P-gp表达、细胞耐药性等功能变化。结果成功构建质粒载体pSUPER-shRNA／mdr1，基因测序证实靶序列插入正确；HepG2／mdr1-si组mdr1基因的mRNA表达水平是耐药株HepG2／mdr1组的56分之一；HepG2／mdr1-si组细胞和阴性对照组HepG2／mdr1细胞的P-gP表达率分别为11.0％和98．6％，P〈0．05；HepG2／mdr1组细胞耐药倍数从62．5下降到1．4，相对逆转效率99．34％；细胞内DNR累积量也明显增加，与对照组比较（79．32％比37．96％），P〈0．05。结论多药耐药基因mdr1质粒表达载体pSU-PER-shRNA／mdr1能在HepG2／mdr1内稳定表达，并逆转其耐药性。

摘要：目的:探讨选择性肝门阻断联合逆行肝切除治疗巨大肝癌对健侧肝组织再灌注损伤、余肝功能的影响。方法:45例巨大肝癌(直径≥10 cm)患者按照Zelen设计的临床分组方案分为对照组和观察组,对照组行完全阻断第一肝门的顺行肝癌切除,观察组行选择性阻断第一肝门的逆行肝癌切除,两组均于肿瘤切除后留取少许健侧肝组织。检测两组患者术后1周总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、前白蛋白(PA)水平及健侧肝组织肝细胞凋亡情况、细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)、丙二醛(MDA)含量、超氧化歧化酶(SOD)活性。结果:与对照组比较,观察组术后1周的ALT明显降低、PA含量明显升高(均P0.05);健侧肝组织肝细胞凋亡水平、[Ca2+]i、MDA含量均明显下降,SOD活性明显增高(P<0.05)。结论:与传统方法比较,选择性第一肝门阻断逆行肝切除术治疗巨大肝癌更有利于减少健侧肝组织的再灌注损伤和保护余肝功能。

摘要：目的构建shRNA／mrp1的质粒表达载体并验证其体外表达效率。方法根据业已筛选出的mrp1基因RNAi靶序列，按照pSUPER的设计要求合成64bp的寡核苷酸序列，将其退火后形成双链并用双酶切法克隆到pSUPER得到质粒pSUPER-shRNA／mrp1，转染感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆，经测序证实后扩增培养并以去内毒素试剂盒提取，然后转染HepG2／mrp1细胞，阴性载体为对照组，Real—time PCR、流式细胞术检测mrp1基因mRNA、MRP1表达、细胞耐药性等功能变化。结果成功构建质粒载体pSUPER—shRNA／mrp1，经基因测序证实靶序列插入正确；HepG2／mrp1组Ct值较GAPDH增加5．61，HepG2／mrp1—si组Ct值比GAPDH升高11．35，mrp1基因的表达水平是耐药株HepG2／mrp1的179分之一；实验组HepG2／mrp1细胞和阴性对照组HepG2／mrp1细胞的MRP表达率分别为11．2％和97．6％，差别有统计学意义（P〈0．05）；药物敏感试验显示HepG2／mrp1细胞耐药倍数从45．0下降到1．2，相对逆转效率99．62％；细胞内DNR累积量也明显增加，与对照组比较（78．58％vs38．44％，P〈0．05）。结论成功构建质粒载体pSUPER-shRNA／mrp1，在HepG2／mrp1内稳定表达，逆转其耐药性。

摘要：目的筛选高效dsRNA/mdr1,以备研究RNA干扰逆转肝细胞癌多药耐药之用。方法首先根据siRNA设计原则,以多药耐药基因(mdr1)为靶基因,设计并选择4~5条siRNA/mdr1,经BLAST后体外转录法合成dsRNA/mdr1,用Oligofectamine试剂分别转染HepG2/mdr1,然后从mRNA、蛋白(P-gp)表达水平和细胞功能变化评价HepG2/mdr1耐药性被逆转的程度,比较各个dsRNA/mdr1的逆转效率,筛选出有效的siRNA/mdr1。结果成功合成5条dsRNA/mdr1(其中1条为阴性对照),dsRNA/mdr1-4mRNA表达(18.73±1.33)%、蛋白表达变化(79.1±1.6)%^(16.8±0.4)%与其他各组细胞比较,有显著性差异;细胞内柔红霉素(DNR)累积量也较其他组明显增加(平均荧光强度79.58,阳性率84.25%,P<0.05)。结论体外转录法结合脂质体转染适用于筛选高效siRNA,肯定了siRNA干扰序列能够有效阻抑mdr1基因编码蛋白p170的功能。

摘要：目的 :本实验设计胃窦胆囊大口吻合术 ,探讨能否利用幽门括约肌来防止胃肠内容物的返流。方法 :本研究选取草原犬 15只 ,随机分为对照组 5只 ,实验组 10只。对照组行开腹关腹术。实验组手术方式为 :保留胃窦神经支配 ,胃窦与胃体离断后 ,行胃窦胆囊吻合、空肠胃体吻合术。并分别在胃窦和十二指肠置造影用塑料管。采用放射免疫法测定对照组术前、术后 4周及实验组术前、术后 1周 ,4周血浆胃泌素 (Gn) ,生长抑素(SS) ,神经降压素 (NT) ,β-内非肽 (β-EP)浓度。在透视下经十二指肠造瘘管、胃窦造瘘管分别注入 2 0 %泛影葡胺 ,观察有无返流及胃窦内容通过幽门情况。结果 :造影结果显示 :无造影剂返流入胃窦 ,造影剂可从胃窦进入十二指肠。定量结果显示对照组与实验组术前与术后胃肠道激素血浆浓度差值无明显差异 (P >0 0 5 )。实验组术前与术后Gn、NT、SS、β -EP血浆浓度无明显差异 (P >0 0 5 ) ;对照组与实验组术后Gn、NT、SS、β -EP血浆浓度无明显差异 (P >0 0 5 )。结论 :用幽门括约肌来代替Oddi氏括约肌行胃窦胆囊吻合术具有防止肠液向胆道返流的作用。

摘要：目的研究siRNA对肝癌耐药细胞系HepG2／mrp1中多药耐药相关蛋白基因（multi—drug-resistant-associated1，mrp1）及其蛋白产物MRP1表达的抑制作用和逆转其耐药性的效果。方法设计合成针对mrp1启动子区域的RNA干扰小片段，转染肝癌耐药细胞HepG2／mrp1。通过RT-PCR和流式细胞仪，在mRNA和蛋白质水平评估RNA干扰对mrp1表达的影响；MTT法检测RNA干扰逆转HepG2／mrp1细胞多药耐药性的变化，按照实验组和亲本组细胞的半数抑制剂量（IC30）评估RNA干扰对细胞耐药倍数的改变。结果在耐药细胞HepG2／mrp1中，RNA干扰明显抑制了mrp1mRNA和蛋白产物MRP1的表达水平，在相同浓度药物作用下实验组细胞耐药性显著下降。结论我们设计的siRNA对肝癌耐药细胞HepG2／mrp1中的mrp1基因有显著的抑制作用，具有良好的逆转多药耐药性的效果。

摘要：目的:筛选靶向人多药耐药相关蛋白基因(mrp1)特异性小分子干扰RNA(siRNA)的有效序列。方法:设计并体外转录合成靶向mrp1的4条siRNA(mrp1-si251,mrp1-si480,mrp1-si795,mrp1-si1016和空白对照si-阴性),转染转基因单因素肝癌多药耐药细胞Hep G2/mrp1。用RT-PCR检测mrp1 mRNA表达,流式细胞仪检测多药耐药相关蛋白表达、细胞内柔红霉素(DNR)蓄积,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞对阿霉素(ADM)的敏感性。结果:4条siRNA均能不同程度逆转Hep G2/mrp1细胞由mrp1介导的多药耐药。转染72h后,mrp1-si795组和mrp1-si1016组的mrp1 mRNA表达水平分别分别下调了(86.36±2.26)%和(85.54±1.04)%,较mrp1-si251组和mrp1-si480组明显下降(P<0.05);细胞内柔红霉素蓄积由多到少依次为mrp1-si795组最多,mrp1-si1016组次之,mrp1-si480组较少,mrp1-si251组最少(P<0.05);mrp1-si795组对ADR耐药的相对逆转率(86.36%)最高,mrp1-si1016组(85.54%)次之,较mrp1-si251组(60.93%)和mrp1-si480组(70.29%)有明显差异(P<0.05);mrp1-si1016组和mrp1-si795组多药耐药相关蛋白表达明显下调。结论:实验设计的靶向mrp1 mRNA的siRNA序列能够不同程度逆转多药耐药相关蛋白介导的人肝癌耐药细胞HepG 2/mrp1的多药耐药性,mrp1-si1016和mrp1-si795效果最好,mrp1-si480较差,mrp1-si251最差。mrp1-si1016和mrp1-si795可以作为进一步实验的靶序列。