摘要：目的利用Luminex xTAG技术，建立能高通量鉴别沙门菌H抗原的xTAG悬浮芯片法，用于沙门菌的血清型别鉴定。方法以沙门菌编码H抗原的fliC和fljB基因为目标基因，选取其保守片段设计上游通用引物，选取可变片段设计下游特异性引物；合成时上游引物的5′端用生物素标记，下游引物的5′端连接特定的TAG序列；标本经多重PCR扩增并标记生物素和TAG序列后，与含anti-TAG序列的编码磁珠混合液杂交分型，通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白的反应报告结果。利用建立的xTAG悬浮芯片法鉴定145株沙门菌日常分离株的H抗原，并与传统的血清凝集试验比较。结果31种沙门菌H抗原经多重PCR扩增后，与xTAG磁珠杂交后可鉴别分型，各H抗原间无交叉反应，且重复性良好，与大肠埃希菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌及志贺菌DNA等亦无交叉反应。对145株沙门菌进行H抗原鉴定，与传统的血清凝集试验比较，其敏感度为95.1%，特异度为100%。结论利用xTAG悬浮芯片法鉴定沙门菌H抗原，特异准确，可在4～5 h内完成90多株常见血清型沙门菌的H抗原鉴定。

摘要：设计引物和探针,优化多重实时PCR条件,以同时检测霍乱弧菌霍乱毒素基因ctxA、副溶血弧菌种特异性基因gyrB和耐热肠毒素基因tdh。该多重实时PCR方法检测产毒素性的O1群(3株)和O139群(44株)霍乱弧菌菌株、不产毒素的O1群(12株)和O139群(6株)及非O1非O139群(7株)霍乱弧菌菌株的ctxA,阳性和阴性结果与普通PCR检测结果100%符合;检测副溶血弧菌种特异性gyrB,116株副溶血弧菌均阳性,而9株其它细菌和72株霍乱弧菌均阴性;检测tdh的阳性和阴性结果也与普通PCR结果完全一致。另外还建立了检测副溶血弧菌菌株trh1和trh2的单重实时PCR方法。

摘要：目的应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测法,建立尖音库蚊抗性酯酶等位基因分型方法。方法根据尖音库蚊抗性酯酶基因保守区序列设计引物;提取单个蚊虫基因组DNA,采用PCR-RFLP分析的方法,对抗性酯酶等位基因分型。结果酯酶基因扩增片段长度为860 bp,经限制性内切酶酶切后,尖音库蚊抗性Est-β11纯合型有5条带(70、89、147、198和347 bp);Est-β2纯合型出现4条带(60、147、207和437 bp);Est-β11/Est-β2杂合型出现5条带;Est-βN纯合型出现3条带(147、207和506 bp)。结论PCR-RFLP方法能快速、有效地检测尖音库蚊抗性酯酶等位基因类型。

摘要：为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测埃可病毒9型病毒核酸,并初步应用于埃可病毒9型的临床标本检测。根据GenBank登录的埃可病毒9型毒株VP1基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,同时对疑似埃可病毒9型病例标本进行检测。该方法对埃可病毒9型的检出有高度特异性,与EV71、CA16、CA24v、CA6、CA10、埃可病毒30型等均无交叉反应,检测灵敏度均达0.1TCID50/mL,可从疑似埃可病例粪便标本中直接检测病毒核酸,检测仅需3~4h。本研究建立的埃可病毒9型TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于临床早期诊断。

摘要：目的建立单管双向荧光PCR方法快速测定人NAD（P）H：醌氧化还原酶1[NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQ01]基因609C／T多态性。方法以人NQ01基因中的609C／T位点，设计双向引物，优化反应条件，应用SYBR Green Ⅰ双向荧光PCR扩增191份人基因组DNA标本，并通过对产物进行熔解曲线分析，根据产物Tm值进行等位基因单核苷酸多态性分型。对其中62份标本用经典的PCR-限制性片段长度多态方法进行基因型分型，验证结果准确性。结果62份样本的单管双向荧光PCR方法的基因型结果与PCR-限制性片段长度多态法分型结果符合率100％。191份样本中，纯合野生型（CC）占28％，杂合型（CT）占50％，纯合突变型（TT）占22％。结论单管双向荧光PCR方法检测NQ01基因609C／T多态性，操作简便、反应过程快速，结果直观，敏感性、准确性和稳定性好，适用于临床样本检测及流行病学调查研究。

摘要：目的:建立双重实时荧光RT-PCR方法(DqRT-PCR)以检测甲、乙型流感病毒。方法:设计甲、乙型流感病毒M基因的特异性引物及双标记探针,优化反应条件,建立双重实时荧光RT-PCR方法(DqRT-PCR)。设计甲型流感病毒HA1、HA3亚型的H1、H3、N1、N2基因的特异性引物,建立双重普通RT-PCR(DRT-PCR)方法。对HA1、HA3和B型细胞分离株进行DqRT-PCR和DRT-PCR检测。对80份发热病人咽拭子标本进行DqRT-PCR和DRT-PCR检测及细胞培养分离病毒。结果:DqRT-PCR检测甲型和乙型靶DNA片段(重组质粒)最低极限为1×103拷贝。DqRT-PCR和DRT-PCR对11株H1N1、16株H3N2和12株乙型细胞分离株检测,符合率100%。DqRT-PCR、DRT-PCR和细胞培养分离病毒对80份咽拭子标本的阳性率分别为:37.5%(30/80)、30.0%(24/80)和43.8%(35/80),检出率差异未见统计学意义(2χ=5.5,P>0.05)。与细胞培养分离病毒法比较,DqRT-PCR的阳性和阴性总符合率为73.7%(59/80),阳性预测值为62.9%(22/35),阴性预测值为88.9%(40/45);经配对2χ检验,差异无统计学意义(2χ=0.76,P>0.05)。结论:建立DqRT-PCR可应用于甲型和乙型流感的检测,以多种检测方法互补将有助于提高临床标本的病毒检出率。

摘要：埃可病毒7型(Echovirus 7,ECHO7)属于小RNA病毒科人肠道病毒属,常引起儿童病毒性脑炎、手足口病和急性迟缓性麻痹等疾病。为了解病毒性脑炎患者脑脊液中分离获得的一株ECHO7毒株(40/Longyou/ZJ)的全基因组特征,进行全基因组测序并分析其分子变异和遗传进化特点。设计引物,提取病毒RNA,PCR扩增和序列测定获得全基因序列。利用Mega4.1、DNAstar、RDP4和SimPlot3.5.1软件分析全基因序列。40/Longyou/ZJ病毒株基因组全长7426个核苷酸(nt),5′端和3′端分别为741nt和100nt的非编码区(Untranslated region,UTR),5′UTR和3′UTR间为一个6585nt长的开放阅读框,编码含2194个氨基酸的多聚蛋白。与GenBank中12株ECHO7代表株的全序列比较发现,核苷酸相似性为79.3%~85.7%,氨基酸相似性为95.5%~97.8%。基于5′UTR、P1和P2区构建的遗传进化树中,40/Longyou/ZJ株与ECHO7参考株均在同一进化分支;但在P3区的遗传进化树中却与其他肠道病毒B组病毒聚类。RDP4和SimPlot3.5.1软件分析均证实40/Longyou/ZJ分离株与柯萨奇病毒B组4型(Coxsackievirus B4,CVB4)存在基因自然重组现象,重组位点主要在编码逆转录酶蛋白的3D区。本研究首次对我国脑脊液中分离的ECHO7进行全基因序列测定和分析,发现40/Longyou/ZJ分离株与CVB4存在基因重组,对研究ECHO7的遗传特性具有重要意义。

摘要：目的:为检测短乳杆菌gyrB基因序列。方法:设计两对简并引物对3种啤酒污染乳酸杆菌进行PCR扩增,获得短乳杆菌部分目的基因片断。并将该片断克隆至pGEM-T Easy载体,经限制性内切酶分析和测序获得短乳杆菌gyrB基因部分序列。结果:通过对序列进行进化树分析,发现该序列与啤酒典型污染菌植物乳酸杆菌gyrB序列相似性较高。结论:短乳杆菌gyrB序列对于建立啤酒中短乳杆菌快速检测具有十分重要的意义。

摘要：目的:建立一种灵敏、快速的PCR法检测啤酒中的乳酸杆菌。方法:设计一对属特异性引物扩增乳酸杆菌的16Sr DNA基因,对7株乳酸杆菌进行检测,扩增片断长度为223 bp,金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、李斯特菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、铜绿假单孢菌5种菌作为阴性对照菌。结果:该引物能扩增7株乳酸杆菌,结果为阳性;阴性对照菌结果为阴性。结论:该方法快速、灵敏、特异,为啤酒中乳酸杆菌的快速检测提供了有效的途径。

摘要：目的:建立鉴定短乳杆菌的实时荧光定量PCR法。方法:根据GanBank登录的乳酸杆菌序列,以gyrB基因为靶目标设计引物和探针,对啤酒中分离到的6株乳酸杆菌进行实验,并对其中一个短乳杆菌样本作定量检测。结果:实时荧光定量PCR对短乳杆菌可产生特异扩增信号,对其他乳酸杆菌无响应。标准曲线的相关系数为0.97739,测得短乳杆菌样本浓度为15635拷贝/m l。结论:实时荧光定量PCR是一种快速、特异、灵敏检测短乳杆菌的方法。