摘要：目的构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行瞬时表达。方法采用RT-PCR技术,设计针对信号肽的简并引物,钓取抗CD25杂交瘤细胞的重、轻链可变区基因,以质粒PAG4622为模板,钓取人抗体IgG1重、轻链恒定区基因,分别将重、轻链可变区基因与相应的恒定区基因进行拼接,将完整的重、轻链嵌合基因分别与真核表达载体pOptiVEC和pcDNA3.3连接,构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,将其通过脂质体法共转染至293T细胞中进行表达。通过RT-PCR法检测嵌合抗体基因的转录水平,ELISA法检测嵌合抗体的表达量,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合活性。结果抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒构建正确;RT-PCR显示嵌合抗体基因在293T细胞中成功转录;转染后48、72、96和120h,细胞培养上清中嵌合抗体的含量分别为7.47、11.72、8.02和18.28ng/ml;FCM检测其能特异性与IL-2Rα链结合。结论已成功构建了抗CD25人鼠嵌合抗体基因的真核表达质粒,并能在293T细胞中瞬时表达。

摘要：目的:构建及筛选高效表达原创性全人源抗人Ig E单克隆抗体的重组工程细胞株。方法:将采用核糖体展示技术筛选到的原创性全人源抗人Ig E单链抗体(sc Fv)基因改构设计为Ig G1κ型全长抗体,构建重组真核表达质粒并电转染CHO-S细胞,Dot-blot法选取多株高表达克隆进行40ml摇瓶批次培养,再据细胞生长特征及抗体表达量选取高表达克隆进行40ml摇瓶及3L摇瓶流加培养研究,选取候选细胞株并对改构前后抗体的生物学活性进行比较研究。结果:成功构建了p MH3-H、p MH3-L、p CApuro-H、p CApuro-L四种重组真核表达质粒并成功共转染CHO-S细胞。完成了4次电转染8轮细胞克隆筛选,获得两株表达量较高的候选克隆Mab1#和Mab2#,在3L摇瓶流加培养中抗体表达量分别达到470mg/L及499mg/L。生物膜光干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)亲和力结果显示Mab1#及Mab2#两株单抗亲和力均达到nmol/L级(10-9),与现有唯一上市的抗人Ig E单抗药物奥马珠单抗(Omalizumab)的亲和力相当。选取Mab1#全长抗体与其改构前的母本单链抗体的表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)中和活性比较结果显示Mab1#抑制h Ig E与FcεRI结合的EC50为3nmol/L,EC90为9nmol/L,较改造前亲和力提高了4.3倍,中和活性(EC50)提高了23.7倍,中和活性(EC90)提高了41.3倍。结论:成功将表达原创性全人源抗人Ig E的单链抗体(约25k Da)改造为亲和力及中和活性均大幅提升的全长抗体(约150k Da),获得2个候选细胞株。

摘要：目的利用实验设计(Design of Experiment,DoE)筛选及优化实验对SARS-CoV-2单抗F61亲和层析工艺参数进行筛选及优化,获得最佳工艺条件。方法选择8个可能在亲和层析中影响实验响应结果的工艺参数并制定其水平范围,利用DoE筛选实验对选择的工艺参数进行8因子2水平筛选实验,通过检测响应值,用统计学软件拟合数学模型,经帕累托图分析获得3个显著影响关键质量属性的关键工艺参数(P<0.05),再选择DoE响应曲面法对关键工艺参数进行优化实验。首先完成全析因实验设计部分,检测响应结果拟合数学模型,分析弯曲项P值判断显著因子的工艺参数范围处于最佳范围内(弯曲P<0.05)后,再根据实验的序贯性补齐中心复合表面设计(central composite face-centered design,CCF)实验,通过检测响应结果拟合响应曲面模型,获得工艺最佳条件范围,最终通过重复试验验证最佳参数值的稳定性。结果在筛选实验中获得在亲和层析阶段影响F61的显著因子为洗脱缓冲液pH、洗脱缓冲液盐浓度、中间淋洗缓冲液盐浓度、平衡缓冲液盐浓度。通过CCF实验最终获得亲和层析中关键工艺参数的最佳条件,当洗脱缓冲液pH为3.2、洗脱缓冲液盐浓度为0.07 mol/L NaCl、中间淋洗缓冲液盐浓度为0.31 mol/L NaCl,F61在亲和层析阶段收率达95.25%,宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量为97.33 ppm,样品单体纯度达98.51%。结论用不同类型DoE方法进行了F61亲和层析阶段工艺参数的筛选和优化,获得了最佳工艺条件,为F61纯化工艺的建立奠定了基础。