摘要：目的:利用原核表达系统重组表达小鼠附睾特异性辅脂酶(meClps),并制备抗meClps抗体。方法:通过生物信息分析meClps蛋白结构,Oligo 6设计引物,PCR法从小鼠附睾cDNA中扩增meClps全长序列并克隆到pMD19-T载体中。将含meClps序列pMD19-T载体通过PCR扩增成熟肽区段序列,重组到pET-21b原核表达载体上,经菌落PCR及测序鉴定后,转化到表达菌株***21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达后用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting检测重组meClps的表达。包涵体沉淀经浓度为2 mol/L尿素洗涤,Tricine-SDS-PAGE分离、染色、脱色,切下目的条带用生理盐水浸泡、磨碎与弗氏佐剂混合后免疫新西兰大白兔获取免疫血清,Western blotting检测抗体与meClps反应。结果:在原核表达系统成功重组表达meClps,目的蛋白主要以包涵体形式存在,制备了高效价的兔抗meClps抗体。结论:成功建立meClps的原核表达系统和获得兔抗meClps抗体。

摘要：目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-599)原核表达载体并表达重组抗原。方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体。测序鉴定后转化工程菌株***21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白。用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况。结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原。结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsper1特异抗原。

摘要：目的　用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus ,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段—gp5 2C末端和pp15 0C末端的DNA序列 ,插入pPIC9K质粒 ,构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。方法　根据人巨细胞病毒糖蛋白gp5 2和磷酸蛋白pp15 0C末端的cDNA序列 ,设计出 2对引物。利用PCR的方法 ,以病毒培养液上清为模板 ,进行二轮PCR扩增 ,把两个目的基因串联在一起 ,将所得的DNA片段经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,筛选出阳性转化子 ,并用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果　从人巨细胞病毒培养液上清中扩增出目的基因 ,PCR反应和双酶切鉴定结果与预期相符。

摘要：为了在毕赤酵母中表达带有组氨酸纯化标记的重组人巨细胞病毒嵌合肽 (rHCMVp) ,根据其基因序列 ,设计引物从pPIC9K rHCMVp上扩增得到目的基因片段 ,并导入毕赤酵母诱导型表达载体pPICZαA中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母X33细胞中 ,筛选获得表达量较高的重组菌株 ,研究了该菌株生长的培养条件 ,包括不同诱导时间、甲醇浓度、pH值对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响。 2L发酵罐进行了高密度发酵 ,经 1 %的甲醇、pH6 0的条件下诱导48h ,最终菌体密度OD60. 0 达到 1 80 ,每升发酵液中含目的蛋白 78. 7mg ,产量比摇瓶提高了 4 8倍。rHCMVp可通过高密度发酵大量获得。

摘要：利用P .pastoris表达人卵透明带ZP3蛋白。设计特定引物从全长hZP3cDNA上扩增含跨膜区序列的人卵透明带ZP3基因片段 ,并在N末端接上串联组氨酸编码序列的重组基因序列 ;扩增片段插入表达载体pPIC9K中 ;线性化后的重组质粒转入P .pastoris中 ,用高浓度G4 18筛选高拷贝菌株 ,然后甲醇诱导目的蛋白表达。用SDS PAGE和Westernblot分析表达产物。结果发现P .pastoris表达的人ZP3蛋白可以分泌到培养液中 ,并且可溶性好。纯化前后的重组人ZP3蛋白均能与兔抗猪ZP3蛋白抗体发生交叉反应 ,证实表达的目的蛋白具有反应原性。

摘要：目的:研究重组人卵透明带ZP3蛋白的差异表达情况。方法:构建8个重组rhZP3的差异表达质粒在毕赤酵母中进行诱导表达,研究跨膜区保留与否、潜在酶切位点突变与否及多聚组氨酸纯化标签设计的位置是否影响rhZP3的表达情况。结果:保留跨膜区会影响重组蛋白泌出胞外而使表达量降低,潜在酶切位点存在会导致重组蛋白被不完全降解,而多聚组氨酸纯化标签设计位置对表达也有一定影响。结论:从表达量和产物完整性综合考虑,以突变型成熟肽为佳,含跨膜区的蛋白则应选用pPICZaA质粒,以便富集得到完整的表达蛋白。

摘要：目的 :为发展多特异性避孕疫苗 ,制备重组抗原pZP3α -hCGβCTP10 9～ 14 5,用基因工程技术构建重组质粒pPIC9K -pZP3α -hCGβCTP10 9～ 14 5.方法 :根据pZP3α全长和hCGβCTP10 9～ 14 5编码的DNA列设计两对引物 ,通过部分重叠聚合酶链式反应 (overlappingPCR) ,扩增出pZP3α -hCGβ -CTP10 9～ 14 5DNA片断 ,克隆到载体质粒pPIC9K中 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR和双酶切反应鉴定重组质粒 ,并用DNA测序仪对重组质粒测序 .结果 :3步PCR扩增出pZP3α -hCGβ -CTP10 9～ 14 5DNA片段 ,插入到载体质粒pPIC9K的克隆位点 ,获得重组pPIC9K -pZP3α -hCGβ -CTP10 9～ 14 5表达质粒 ,测序结果显示插入序列与设计预期完全一致 .结论 :重组质粒pPIC9K -pZP3α -hCGβ -CTP10 9～ 14 5构建成功 ,为表达重组抗原pZP3α -hCGβ -CTP10 9～ 14 5。

摘要：将人绒毛膜促性腺激素β－亚基的羧基肽（ＣＴＰ）与羊黄体生成素（ｏＬＨ）的α－亚基融合，通过设计两对引物，用部分重叠聚合酶链式反应（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲ）的方法构建了羊的α亚基ＣＴＰ嵌合体．这个嵌合体被克隆到ｐＰＩＣ９Ｋ质粒中，用电打孔方法转入巴氏毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ），并获高效表达．表达蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明分子量约为２８ｋＤ．２．５Ｌ发酵罐大量培养，产量可达２．０ｇ／Ｌ．

摘要：目的 :设计和合成适合在昆虫细胞中表达的一个人ZP3B细胞表位的DNA序列。方法 :根据国外的研究基础 ,设计由人ZP3的B细胞表位肽段和外源Th细胞表位肽段串联而成的 4 5肽嵌合肽序列 ,并根据昆虫细胞对密码子的偏爱性设计出该嵌合肽的DNA序列。然后人工合成该嵌合肽的DNA链 ,并克隆到PUC18载体上。结果 :通过酶切分析和测序证明 ,合成的DNA与所设计的嵌合肽DNA序列一致。结论 :　按设计合成了人ZP3的B细胞表位和外源Th细胞表位串联而成的嵌合肽DNA序列。

摘要：目的 :为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原 ,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG -pPIC9K ,转化嗜甲醇酵母 .方法 :根据βhCG的cDNA序列设计两条引物 ,使上游带EcoRI酶切位点 ,下游带NotI酶切位点 ,以质粒 βhCG -PBSKS为模板 ,进行PCR扩增反应 ;将所得的DNA片段经EcoRI和NotI双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG -pPIC9K .再用电打孔法转化酵母 (Pichiapastoris) ,用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G4 18的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株 .结果 :用所设计的引物扩增出两端分别带EcoRI和NotI酶切位点的βhCGDNA片段 ,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆 ,经PCR反应和双酶切鉴定表明重组质粒是 βhCG -pPIC9K ,并转化嗜甲醇酵母获得耐受 4mg/mLG4 18的菌株 .结论 :构建了重组质粒 βhCG -pPIC9K并获得插入重组质粒 βhCG