摘要：目的应用近年发展的基因编辑技术成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）引导的Cas9核酸酶特异性靶向切割HBVDNA基因。方法基于慢病毒载体的lentiCRISPRv2系统，我们设计了3个特异靶向HBV基因组的向导RNA序列（guideRNA，gRNA）。质粒pUC18-HBV1．2和lentiCRISPR-gRNAs共转染HepG2细胞，或lentiCRISPR-gRNAs与相关慢病毒载体转染293T细胞后产生相应慢病毒。用慢病毒处理整合了HBVDNA的HepG2．2．15细胞或者HepDE19细胞系：并用慢病毒处理基于C57BL／6小鼠腺相关病毒HBV复制模型。结果单靶向CRISPR／Cas9切割可以抑制30％～50％病毒蛋白产生。两个或三个靶向切割则显著提高抑制效率，可达70％-90％。以慢病毒体系处理HepG2．2．15或HepDES19细胞时，HepDES19细胞中HBeAg下降幅度约为HepG2．2．15细胞中的3倍。HBV复制小鼠模型在CRISPR／Cas9慢病毒处理后，血清中HBsAg和HBeAg可转为阴性。结论CRISPR／Cas9系统多位点靶向切割可高效清除细胞内基因组，相对于整合于染色体的基因组，游离于细胞核的HBV基因组对此靶向切割系统更加敏感。