摘要：PCR扩增BMP-2与BMP-7的编码基因,利用重叠PCR以柔性肽(Gly4Ser)5编码序列将二者串连并克隆到质粒pIRESneo3上,转染CHO-K1细胞得到混合稳定克隆。ELISA检测培养液中BMP-2/7异源二聚体蛋白的表达水平为230.75±13.34ng/mL,以此为条件培养基处理成骨细胞株MC3T3,对照组为分别含有CHO-K1细胞及大肠杆菌表达的BMP-2同源二聚体以及PBS的条件培养基。结果发现碱性磷酸酶染色与茜素红染色差异明显,定量RT-PCR显示分子指标OC、ALP、Runx2与Osx的转录水平明显增高(P<0.05),Luciferase报告基因检测BMP/Smad通路活性较对照组升高明显(P<0.05)。首次设计构建了BMP-2/7异源二聚体蛋白,其成骨活性显著高于BMP-2同源二聚体。

摘要：翻译起始区 (TIR)的二级结构是影响翻译效率的决定性因素 ,同时密码子的偏好性问题也是个至关重要的方面。基于以上两点考虑 ,对hbFGF 5’末端 35个碱基进行了改造 ,对其中 4个位点进行了定点突变 ,另有 4个位点进行了随机点突变。这些突变都可能造成TIR二级结构变化。这 4个随机突变共有 32种组合 ,使用RNA结构预测软件DNASISv2 .5对这 32种序列分别模拟其二级结构且计算其自由能 ,并选取了 10条自由能最高的序列。根据这10条序列 ,分别设计引物引入突变 ,克隆至表达载体pET 3c上 ,然后转化宿主菌E .coli,通过诱导表达纯化及生物测活等常规实验方法 ,最后确定有两株为高表达菌株 ,从某种程度上证明了用计算机辅助设计定点突变的方法来优化外源基因在E .coli中的表达是有效且很有潜力的。

摘要：目的:构建bcl-2特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步观察其对膀胱癌细胞生长的影响。方法:根据GenBank提供的bcl-2cDNA序列,设计双链小干扰RNA(siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(shRNA)的DNA序列,并与含U6启动子的pGenesil-1质粒定向连接,构建真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。转染T24细胞,采用半定量RT-PCR观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响;用MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用。结果:构建了bcl-2siRNA的真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555,并经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。转染T24细胞72h后,RT-PCR显示bcl-2基因表达下调接近80%;MTT发现T24细胞的体外生长受到明显抑制。结论:bcl-2的特异性siRNA真核细胞表达载体成功构建,有效沉默bcl-2在膀胱癌细胞中的表达,抑制了癌细胞的生长。

摘要：背景:Dlxin1可与成骨相关转录因子Dlx、Msx家族成员相互作用调节其转录活性,骨形态发生蛋白2可诱导小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T1/2)向成骨细胞分化。目的:对C3H10T1/2小鼠胚胎成纤维细胞中Dlxin1基因的表达及骨形态发生蛋白2调控机制进行初探。设计、时间及地点:细胞分子水平实验,于2007-03/10在暨南大学生物工程研究所实验室完成。材料:C3H10T1/2细胞为ATCC产品,骨形态发生蛋白2为自产,DH5α为自备。方法:用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨形态发生蛋白2对基因表达的影响,用双荧光报告载体系统搜寻Dlxin1的上游启动子元件,用凝胶迁移实验(EMSA)对其精确定位。主要观察指标:①细胞中Dlxin1基因mRNA的表达情况。②pGL3-Dlxin1系列缺失突变报告载体荧光活性及启动子片段与C3H10T1/2细胞核蛋白的结合能力检测。结果:在转录水平上骨形态发生蛋白2可以诱导Dlxin1基因表达上调;Dlxin1启动子基础活性和骨形态发生蛋白2诱导活性调控区域均位于转录起始位点上游-943～-728bp之间;EMSA证实,-758～-748bp这一片段是调控核心区域。结论:转录因子通过与Dlxin1启动子上游TATAbox结合来调控Dlxin1基因的转录。

摘要：为提高纳豆激酶在大肠杆菌中的表达量 ,在不改变蛋白质序列的前提下 ,对纳豆激酶氨基端编码前 2 0个氨基酸的序列进行改造 ,以降低此区域的GC含量及稀有密码子数量 ,其中有 3个位点直接采用T ,另有 4个位点采取不确定突变的方式 ,产生 1 6种组合 ,由此而得 1 6条序列 ,利用生物信息软件DNASISv2 5对这些序列的二级结构进行模拟 ,取得自由能绝对值最低的 6条序列设计引物 ,克隆至表达载体pET 3c,导入大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,其中有 3株菌形成明显高效表达。

摘要：本研究构建3个针对小鼠Qa-1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒,观察其对Qa-1基因的沉默作用,筛选出有效靶位。通过美国Ambion公司提供的siRNA web设计工具,选择3段针对Qa-1的siRNA,交由晶赛公司合成3个小发夹表达质粒,采用脂质体转染法转染NIH3T3细胞,第1、2、3组细胞分别转染3个小发夹表达质粒,第4组细胞单纯加入脂质体作为阴性对照,收集转染后24、48、72小时的细胞,用RT-PCR技术及流式细胞术对Qa-1在RNA水平的变化和细胞表面表达进行分析,筛选最有效的干扰片段。结果表明:成功构建了3个针对小鼠Qa-1的小发夹表达质粒。RT-PCR及流式细胞术检测证实,转染后3个组shRNA载体均可抑制Qa-1基因的表达,但抑制程度不一:24、48、72小时3个组细胞表面Qa-1表达减低率分别为H2-T231:60.9%,81.9%,43.6%;H2-T232为:64.5%,73.9%,61.1%;H2-T233为:61.9%,71.2%,47.5%.其中H2-T232组在3个时间点抑制作用均最明显。结论:构建的3个针对Qa-1的小发夹表达质粒均能抑制Qa-1的表达,其中H2-T232具有最有效抑制作用。

摘要：目的探讨RNA干扰（RNAi）技术沉默Bel-2基因表达对人膀胱癌细胞株T24增殖的影响。方法针对Bcl-2mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板，构建pGenesil-1-Bcl-2siRNA重组质粒，转染T24细胞。采用Western blot检测重组质粒对Bel-2蛋白表达的影响，MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用，Annexin-V—PI双染法流式细胞术（FCM）检测转染重组质粒后细胞的凋亡状况。结果成功构建了pGenesil-1-Bel-2 siRNA重组质粒，并成功转染T24细胞。重组质粒抑制Bcl-2基因的表达接近70％；转染重组质粒后，T24细胞的活力降低为（66．9±5．6）％；重组质粒组的T24细胞凋亡率为34．55％～45．39％。结论pGenesil-1-Bel-2 siRNA重组质粒明显下调Bel-2在膀胱癌细胞中的表达，并抑制肿瘤细胞生长，促进其凋亡。