摘要：为建立简单快捷的内、外源性禽白血病病毒(ALV)的鉴别检测方法,本研究根据外源性ALVA亚群标准株RAV-1的p27、env基因以及内源性ALVE亚群标准株ev1的env基因的保守序列,设计3对特异性引物,可分别对ALV、外源性ALV(A、B亚群)和内源性ALV(E、J亚群)进行扩增,扩增产物分别为793bp、387bp和234bp,通过对各反应条件的优化建立了同时检测并鉴别内、外源性ALV的多重PCR方法。该方法特异性良好、灵敏度可达到2×103copies,利用该方法和ELISA对5份现地病鸡组织样品和10枚疑似感染内源性ALV的鸡胚进行检测,结果表明:4份病鸡样品均扩增出3条特异性片段;而9枚鸡胚仅扩增出793bp和234bp的特异性片段,2种检测方法的符合率为100%。该方法为内、外源性ALV的临床鉴别诊断奠定了基础。

摘要：在马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体成功构建并优化的基础上,构建了EIAV基因转移载体包装盒表达重组质粒。分别根据EIAV驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆(pLGFD3-8)和驴白细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆pOK8266T序列,设计并合成引物,扩增EIAVgag/pol全基因和rev基因的第2个外显子,分别插入真核表达载体pCDNA3.1(+),获得表达载体pCDFGP和pCDREV,与亲本株的核苷酸同源性分别是99.6%和99.8%,编码蛋白Gag、Pol及Rev蛋白的推测氨基酸同源性分别为99.2%、98.3%和100%。利用脂质体法,分别将pCDFGP和pCDREV单独及共转染HEK293细胞,利用EIAV阳性血清分别进行间接免疫荧光抗体试验(IFA)和蛋白免疫印迹试验(westernblot),检测外源蛋白的表达情况。结果表明,双质粒共转染的细胞中转染后48h可检测到特异性荧光,转染后60h的细胞裂解产物中可以检测到55ku的Gag蛋白及26ku的p26蛋白,而单独转染pCDFGP和pCDREV的细胞,IFA和western blot试验结果均为阴性。结果表明同时存在gag/pol和rev基因第4外显子的情况下,EIAV包装盒才能表达。