摘要：芽胞杆菌(Bacillus)在自然界中广泛存在,是一类重要的生防资源。以芽胞杆菌为对象建立简便高效的遗传学操作技术有助于相关分子机制研究的开展。本研究采用分子生物学手段构建可简便高效地用于芽胞杆菌基因敲低的重组质粒pBD1。为了验证pBD1在芽胞杆菌中基因敲低效率,进一步设计杀线虫芽胞杆菌(Bacillus nematocida) B16丝氨酸蛋白酶基因bace16的单向导RNA (single guide RNA,sgRNA),将其插入重组质粒pBD1,构建bace16低水平表达载体,电转入B16后比较突变株与野生株的bace16表达差异。结果显示,本研究基于dCas9成功构建了用于芽胞杆菌的可逆型基因敲低重组质粒pBD1,利用qRT-PCR和酶活性测试方法,成功获得了B16中bace16基因表达水平降低的突变株;将异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside, IPTG)移除后,bace16表达基本回复到野生型水平。本研究构建了适用于芽胞杆菌的可逆型基因敲减重组质粒,建立了芽胞杆菌基因敲低及互补系统,为研究芽胞杆菌基因功能提供了基础资料。

摘要：【目的】从松材线虫伴生菌中筛选出高效降解纤维素的细菌菌株,初步鉴定后,对其相应的纤维素酶基因尝试克隆。【方法】首先从河南南阳松材线虫病疫区采集到的木材样本中,分离获得松材线虫。采用刚果红平板初筛法,从松材线虫伴生菌中获得具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株。基于该菌株的形态学、生理学及16 s rDNA序列特征等对高活性菌株进行分类鉴定。设计兼并引物,从高活性菌株中克隆该菌株的纤维素酶基因,并进行序列分析。【结果】获得7株具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株,其中编号为C8的菌株酶活最高。经鉴定该菌株归为肠杆菌属,命名为Enterobacter sp.C8。进一步从C8菌株中成功克隆出该菌株的一个全长1104 bp的纤维素酶基因(GenBank JQ845065),在NCBI比对后发现该基因分别与产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)KCTC 2190的纤维素合成酶亚单位BcsC的核苷酸序列有97%的同源性,氨基酸序列有92%的同源性;与克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的endo-1,4-D-glucanase基因有82%的同源性,与不可培养的细菌内切纤维素酶基因有82%的同源性。【结论】本文首次从松材线虫伴生菌中筛选到了一株简单的产纤维素酶的细菌菌株并从中克隆出了一个新型纤维素酶基因,为下一步进行新能源的利用奠定了理论基础。

摘要：随着我国农业的大力发展,塑料地膜和农药被广泛投入到农业生产中,而塑料地膜降解形成的微塑料和农药在土壤中累积也带来诸多环境问题.目前微塑料与农药单一作用的环境生物学效应已有报道,但两者复合胁迫对作物生长和根际土壤细菌群落的影响研究较少.因此,设计高密度聚乙烯微塑料(HDPE,500目)与磺酰脲类除草剂代表品种氯嘧磺隆共处理,研究其对大豆生长的影响,并通过高通量测序技术、互作网络和PICRUSt2功能分析,探究HDPE和氯嘧磺隆复合胁迫对大豆根际土壤细菌群落多样性、结构组成、菌群网络和土壤功能的影响,阐明HDPE和氯嘧磺隆对大豆的复合毒性.结果表明1%HDPE处理延长氯嘧磺隆在土壤中的半衰期(由11.5 d升至14.3 d),并且HDPE和氯嘧磺隆复合胁迫较单一污染物对大豆生长的影响更为明显.HiSeq 2500测序表明复合胁迫下的大豆根际细菌群落由20个门、312个属组成,门和属的组成数量显著少于对照和单一处理,并降低具有潜在生物防治特性、植物促生特性等功能菌属的相对丰度(如Nocardioides和Sphingomonas等).Alpha多样性表明复合胁迫显著降低大豆根际细菌群落的丰富度与多样性,Beta多样性则表明复合胁迫显著改变大豆根际细菌群落结构.组间样品LEfSe和PICRUSt2功能分析表明复合胁迫调控根际细菌群落的优势菌群,并减弱土壤氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢等二级功能层的丰度占比.由属水平网络分析推测复合胁迫降低土壤细菌间的总连接数和网络密度,使网络结构简单化,维持网络稳定的重要菌群种类也发生变化.研究结果表明HDPE和氯嘧磺隆复合胁迫显著影响大豆生长,并改变大豆根际细菌群落结构、土壤功能和网络结构,相较于单一处理,复合胁迫的潜在危害更大.研究结果可为评价聚乙烯微塑料和氯嘧磺隆生态风险,以及污染土壤修复提供指导.

摘要：【目的】旨在用毕赤酵母高效表达灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】借助DNAworks 3.1软件设计、优化引物,用自己构建的基因合成、定点突变平台合成了毕赤酵母密码子偏好性的灰盖鬼伞过氧化物酶基因,测序后构建在表达载体pPICZαA上,整合于巴斯德毕赤酵母GS115染色体,来自酿酒酵母的α因子作为信号肽序列指导重组蛋白的分泌表达。从82个PCR检测为阳性的酵母转化子中筛选出6株高Zeocin抗性的菌进行表达,选表达酶活性最高的作为实验菌株命名为CIP/GS115。【结果】以ABTS为底物时,CIP/GS115在甲醇诱导第4天酶活最高达到487.5U/mL,是目前摇瓶培养诱导表达灰盖鬼伞过氧化物酶活性最高报道。纯化后的酶最适反应温度为25℃,45℃酶反应速度是最适温度时的61.5%,在低于40℃时比较稳定,超过45℃稳定性迅速下降。最适反应pH为5.0,在p H 4.5-6.5之间比较稳定。以不同的底物研究纯酶底物特异性发现最适底物的顺序是:ABTS>愈创木酚>2,6-二甲氧苯酚>2,4-二氯苯酚>苯酚。【结论】灰盖鬼伞过氧化物酶在毕赤酵母中的高效分泌表达和高的特殊活性为该酶在废水处理、染料脱色等方面的工业化应用奠定了一定基础。

摘要：【目的】从蠼螋肠道细菌菌株Q5中获得一个新型耐碱纤维素酶基因,通过异源表达、酶学性质及功能分析,旨在为以后进一步研究开发高温碱性纤维素酶提供一些理论参考。【方法】采用刚果红平板初筛法,从河南南阳宝天曼国家级自然保护区落叶堆下的昆虫蠼螋肠道中,获得具有分泌较高活性碱性纤维素酶的细菌菌株。基于该菌株的形态学、生理学及16S rRNA序列特征等对高活性菌株进行分类鉴定。并通过设计简并引物,从高活性菌株中克隆出该菌株的纤维素酶基因,并进行序列分析,并导入大肠杆菌BL21中表达。【结果】获得1株具有分泌较高活性碱性内切葡聚糖酶的细菌菌株Q5,经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌,进一步从Q5菌株中成功克隆出该菌株的一个全长1500 bp的内切葡聚糖酶基因(GenBank KR067575),在NCBI比对后发现该基因的氨基酸序列与芽孢杆菌菌株LM 4-2的耐碱性β-1,4-内切葡聚糖酶基因(AKE23721.1)有98%的同源性。重组菌经优化培养,细胞破碎后上清液中的酶活力可达3.46 U/mL,是出发菌株Q5(2.05 U/mL)的1.69倍。经正交实验优化后的酶活力为4.99 U/mL。酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度与pH值分别为50°C与pH 8.5,在pH 8.0和9.0保温48 h,其酶活力仍然维持到最高酶活的82%和81%;该酶在50°C以下较稳定,60°C以上酶活迅速降低。10 mmol/L的Ca^2+和Mg^2+对酶的活性有明显促进作用,重组酶Ega5的Km和Vmax分别是2.217 mol/mL和9.606μmol/(min·L)。该重组酶对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有显著抑制作用。【结论】本文首次从蠼螋肠道中筛选到了一株产碱性内切葡聚糖酶的细菌菌株并从中克隆出了一个碱性纤维素酶基因,为该酶在碱性条件的应用奠定了理论基础。

摘要：“做作业”是小学数学学习的重要环节,“作业批改”是教育教学工作的重要手段。根据多年的实践经验,不同的课题布置不同的作业,针对不同的作业采取多种批改方法,并运用特殊符号给学生评价作业,通过训练学生能熟知每个符号的含义,并能据此自我检查改错,以及运用信息技术设计多样化的作业并实行网上批改、查阅。通过不断地反思和总结,使得自己提高了批改数学作业的效率,提升了教学质量。