摘要：【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得CD 163(cluster of differentiation 163)单等位基因表达的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并探究其介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的特征,为深入研究CD 163基因在PRRSV感染中的作用机制奠定基础。【方法】在猪CD 163基因外显子1区域设计8条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接到pX458载体中,通过T7E1酶切试验检测不同sgRNA载体的活性;将活性较高的3条sgRNAs表达载体电转染到iPAMs中,通过流式细胞术分选单克隆细胞,对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定、蛋白表达检测、脱靶分析以及PRRSV感染分析。【结果】在设计的8条sgRNAs中有3条基因编辑效率在28%以上。基因型鉴定结果表明,50株片段敲除的单克隆细胞中有4株符合预期的CD 163单等位基因表达的iPAMs,效率为8%。蛋白表达检测和脱靶分析结果显示,CD 163单等位基因表达的iPAMs中CD163蛋白表达量显著下降(P0.05)。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统构建了可以正常感染PPRSV的CD 163单等位基因表达的iPAMs,为阐明CD163在猪繁殖与呼吸综合征传染病中所起的作用以及培育抗病猪新品种奠定了基础。

摘要：根据已经公布的植酸酶appA2基因序列,设计合成了1对特异性引物,应用RT-PCR技术从大肠杆菌中扩增得到植酸酶appA2基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组真核表达质粒pcDNA-appA2,对重组表达质粒鉴定正确后,转染猪PK15细胞,经G418筛选后,通过实时荧光定量PCR检测细胞内appA2表达,同时测定细胞内植酸酶的活性,检测结果表明,本试验成功构建了pcDNA-appA2重组真核表达载体,转染细胞后appA2的表达量是对照组的1 686.55倍,同时具有较好的植酸酶活性,为通过生物反应器制备植酸酶研究奠定了基础。

摘要：旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的IPEC-J2(猪空肠上皮细胞系)细胞,揭示细胞表面分化抗原13(cluster of differentiation 13,CD13)在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用。本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计2个向导RNA(guide RNA,gRNA),命名为g3、g5,然后分别将g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP载体骨架上,电转染IPEC-J2细胞,48 h后通过流式细胞术分选具有双荧光标记的细胞,培养并获得单克隆细胞,PCR扩增、测序,从而获得CD13基因纯合敲除的阳性细胞系。对获得的20个细胞单克隆进行PCR,并挑取部分克隆PCR产物测序,发现共有7个克隆发生了基因片段缺失,其中1个克隆为单等位基因片段缺失,3个克隆为双等位基因杂合片段缺失,3个克隆为双等位基因纯合片段敲除。本研究检测双等位基因纯合片段敲除细胞的蛋白表达水平,其结果显示,在该纯合敲除细胞中CD13蛋白几乎不表达,表明成功构建了CD13敲除的IPEC-J2细胞系。本研究获得的CD13基因敲除细胞系为探究CD13在猪肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用奠定了基础。

摘要：野生型p53诱导的磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,Wip1)是蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase type 2C,PP2C)家族中的一员,可以靶向调控机体内多种重要的信号分子,如p53、MAPK和Chk1/Chk2等,在动物细胞周期、增殖、分化、凋亡、衰老、自噬及DNA损伤修复等生理过程中发挥重要作用。Wip1基因缺失会使小鼠生殖激素水平失衡,且该基因通过ATM、Wnt、凋亡和炎症等信号通路影响精子生成过程,导致雄性动物繁殖力下降。此外,Wip1基因还可通过动态平衡调节DNA损伤反应和去磷酸化作用来影响卵母细胞和胚胎发育,从而调控雌性动物的生殖。免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统,其与炎症反应和肿瘤发生有着紧密的联系。Wip1基因缺失会使病原体敏感性增强,影响T细胞、B细胞和中性粒细胞迁移及凋亡,进而导致炎症反应。作为原癌基因,Wip1基因通过调控各种信号分子影响DNA损伤修复、细胞周期进程及细胞凋亡等,参与肿瘤发生。因此,Wip1基因在动物繁殖调控和免疫调节中扮演着重要角色。目前,Wip1基因受到越来越多学者的关注,特别是其调控动物疾病发生发展的机制已成为研究热点。本研究主要综述了Wip1基因对动物繁殖及免疫的调节作用,以期为家畜育种、疾病防治及靶向治疗提供新思路。

摘要：[目的]获得分化抗原163(cluster of differentiation 163,CD163)基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵过程中的作用。[方法]将靶向CD 163基因第7外显子的sgRNA质粒(pX330-sgCD163)转染至iPAMs,转染48 h后通过有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型鉴定,通过Western blotting和脱靶分析来筛选CD 163基因敲除的iPAMs;通过实时荧光定量PCR、Western blotting、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和半数细胞培养物感染量(50%tissue culture infective dose,TCID 50)等试验分析CD 163基因敲除的iPAMs感染PRRSV的特征。[结果]测序结果表明,100株单克隆细胞中有1株CD 163双等位基因敲除的iPAMs,敲除效率为1%;Western blotting结果显示,CD 163基因敲除的iPAMs中检测不到CD163蛋白的表达,且在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。实时荧光定量PCR结果表明,与野生型iPAMs组相比,CD 163基因敲除的iPAMs组病毒拷贝数极显著降低(P<0.01);Western blotting和IFA结果表明,在接毒24 h后的CD 163基因敲除的iPAMs组中未检测到PRRSV-N蛋白的表达;TCID 50试验结果同样显示,在CD 163基因敲除的iPAMs组中未观察到细胞病变。[结论]本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了CD 163基因敲除的iPAMs,该细胞系可以完全抵抗PRRSV感染。该细胞系的建立为后续研究PRRSV与CD163蛋白的互作机制提供了新型试验材料。

摘要：为探明猪FBXL8基因的分子结构特征,本试验以人FBXL8基因的mRNA序列作为信息探针,搜集猪同源基因EST序列,并构建EST重叠群Contig,设计出合适的引物,以湖北通城、大白和长白猪基因组为模板,应用PCR技术克隆测定FBXL8基因的第二内含子序列。序列分析结果表明猪FBXL8基因第二内含子为855 bp。通过运用SEQMAN软件对3个品种的序列比较分析,初步发现第二内含子的第325、361和493位碱基为SNP位点。

摘要：试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因敲除的猪回肠上皮(immortal pig intestinal-2I,IPI-2I)细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体(pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5)共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞(片段敲除效率为15.5%),其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。

摘要：动物生长发育调控是一个高度复杂而精细的生理过程，受多种因素如神经、体液、遗传、营养及环境等的影响。其中，动物神经内分泌生长轴各因子（激素、受体、结合蛋白等）及其基因对动物的生长发育起着关键的作用。正常情况下，下丘脑接受体内外的信息，生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone，GHRH）和生长抑素（somatostatin，SS），调节垂体生长激素（growth hormone，GH）的分泌，GH通过与生长激素结合蛋白（growth hormone binding protein，GHBP）结合而运输，与靶器官上的生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）结合，促使类胰岛素生长因子（insulin—like growth factors，IGFs）的产生并进入血液循环，IGFs再通过其结合蛋白（insulin—likeg rowth factor binding protein，1GFBP）转运到全身组织细胞，促使组织细胞的生长与分化。五指山猪（Wuzhishan Pig，WZSP）是一种原产于中国海南省山区的小型猪。五指山猪成年体重仅为35kg，是正常猪体重的15％～30％，是一种频临灭绝的珍稀物种。五指山猪具有以下特征：体型小，性成熟早，肉质好，耐近交和遗传稳定。为了开发和应用这一珍稀猪种的遗传资源，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所从1989年就已经开始对五指山猪进行近交系培育，现在已经获得五指山猪近交系18代（近交系数为0．974），但五指山猪的矮小机理至今不明。为了探讨五指山猪矮小的分子机理，对五指山猪生长激素及其受体基因进行了克隆和序列分析。从纯种近交16代五指山猪的垂体和肝组织提取总RNA，根据GenBank中猪生长激素及其受体基因的序列（登录号分别为X53325，NM214254）设计特异性引物，对五指山猪生长激素及其受体基因进行扩增，然后对PCR产物进行回收、克隆测序。测序结果表明，五指山猪生长激素基因开放阅读框长651bp，编码216个氨基酸，其中包含26个氨基酸的信号肽；生长激素受体基因编码区编码639个氨基酸，其中包含18个氨基酸的信号肽。运用生物学软件DNAssist2．2将五指山猪和普通猪的生长激素基因编码区进行比对发现，五指山猪生长激素基因的编码区有4个突变：26号位置发生C→T突变，该突变导致缬氨酸代替丙氨酸；65号位置发生G→A突变，该突变导致谷氨酰胺替换精氨酸；114号位置发生T→C突变，252号位置发生A→G突变，但是这两个突变都未引起所编码氨基酸的变化。五指山猪和普通猪生长激素受体基因比对发现，1143号位置的G→T突变引起天冬氨酸替换谷氨酸；1225号位置的G→T突变导致丝氨酸替换丙氨酸；1666号位置C→G突变导致缬氨酸替换亮氨酸；1739号位置C→G突变导致丙氨酸被甘氨酸所代替；1801号位置G→A突变导致缬氨酸被异亮氨酸代替；1248号位置G→A突变，1287号位置G→A突变和1827号位置G→C突变均为同义突变，未引起相应编码氨基酸的变化。五指山猪生长激素基因有两处氨基酸替换，这两处替换发生在信号肽区，对成熟蛋白的结构和功能没有影响，但是有可能会影响蛋白的运输。五指山猪生长激素受体基因突变都发生在生长激素受体的胞内结构域，这些突变可能改变生长激素受体的空间构像，从而对生长激素受体的胞内信号转导产生一定的影响，影响生长激素一生长激素受体一胰岛素样生长因子轴的信号级联，削弱生长激素的促生长作用。

摘要：卵丘细胞是指包裹在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群,是一类与生殖细胞密切相关的体细胞。大量研究表明,卵丘细胞在卵母细胞的发育、成熟、排卵、受精以及受精卵发育过程中发挥了重要作用,卵母细胞与卵丘细胞之间的相互作用已成为关注的焦点。由于卵丘与卵母细胞之间的相互作用十分复杂,人们对参与这一细胞间互作的信号通路和反应过程相关基因的表达还缺乏深刻了解。本研究对比了有致密完整卵丘细胞包裹的卵母细胞和无卵丘细胞包裹裸卵的体外培养成熟过程中的成熟率、孤雌激活卵裂率、囊胚率的差异,并运用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)和半定量RT-PCR技术,比较了两者在基因表达上的差异,目的是进一步认识卵母细胞的发育机制,并推测卵母细胞和卵丘细胞间的相互作用的分子机理。材料与方法:采集大量猪的卵母细胞,捡出A级卵(胞质均匀且卵丘细胞层完整紧密,包裹五层以上的卵)和C级卵(有极少或无卵丘细胞包裹的卵)分别进行了体外培养、孤雌激活。同时对两类卵母细胞抽提RNA,进行DDRT-PCR,筛选出差异条带进行克隆测序,最后根据测序结果设计特异引物,最后通过半定量RT-PCR对筛选出的差异条带进行验证。结果与讨论:(1)在体外培养和成熟实验中,卵丘卵母细胞复合体(COC)中的卵母细胞的成熟率和卵裂率均显著高于裸卵的,而裸卵的囊胚率为0,表明卵丘细胞在卵母细胞的发育和成熟过程中起到了关键作用。(2)利用了3对锚定引物和随机引物,共发现了16条差异表达的片段,经过克隆测序最终得到了14条差异表达的序列,经过比对发现,其中3个片段分别与人的PELP1,Myo5b,calpastatin基因高度同源,另外5条序列与猪的EST同源,但功能未知,其余6条序列未找到同源片段。(3)经过半定量RT-PCR验证表明,大约有一半的条带在差异显示和半定量RT-PCR实验中的结果一致,其中PELP1,Myo5b基因在有卵丘细胞的卵母细胞中的表达量高于裸卵的,而calpastatin基因只在有卵丘细胞的卵母细胞中表达,在裸卵中则没有检测到。(4)相关研究表明,差异表达基因在雌激素受体的调节、细胞膜间的信息传导、细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用,这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。上述研究为进一步认识卵母细胞的发育机制,并推测卵母细胞和卵丘细胞间的相互作用的分子机理奠定基础。这些差异表达的基因也是卵母细胞成熟过程中的关键因子,可以作为筛选卵母细胞进行下一步操作的标记基因。