摘要：目的:采用人工神经网络模型及在线软件BIMAS和SYFPEITHI共同预测汉滩病毒核蛋白HLA-A)02限制的CTL表位,并对CTL表位进行实验鉴定。方法:①选取2004-11解放军第四军医大学唐都医院住院的肾综合征出血热患者1例,汉滩病毒特异性IgM抗体为阳性。无菌抽取肾综合征出血热患者外周血,分离外周血单个核细胞,液氮冻存备用。②采用JavaNNS软件模拟神经系统对信息的处理过程,建立人工神经网络模型。训练人工神经网络的9肽包括584种HLA-A)02结合肽和130种HLA-A)02非结合肽,随机数字表法分为3部分:80%为训练肽(用来训练模型,使其学习其中隐含的规律),10%为确认肽(防止训练过度,使训练在适当的时候终止),10%为试验肽(对训练好的模型进行初步的评价)。无、低、中、高亲和力9肽训练人工神经网络的输出值分别为0.1,0.4,0.6,0.8。因此,人工神经网络模型的默认阈值为0.4。此外,还应用在线软件BIMAS和SYFPEITHI,共同预测汉滩病毒核蛋白的CTL表位。③采用ELISPOT鉴定汉滩病毒核蛋白特异的HLA-A)02限制的CTL表位。结果:①人工神经网络、BIMAS和SYFPEITHI预测的准确度:3种方法预测的灵敏度分别达到0.89,0.78,0.97,特异性分别为0.90,0.87,0.20。三者共同预测到23个汉滩病毒核蛋白特异的CTL表位。②HLA-A)02限制的CTL表位的实验鉴定:在可刺激肾综合征出血热患者外周血单个核细胞产生阳性反应的3条15肽中,预测到了4个HLA-A)02限制的CTL表位。经ELISPOT实验证实,其中的2种9肽可刺激HLA-A)02阳性的肾综合征出血热患者外周血单个核细胞分泌γ干扰素。结论:肾综合征出血热患者中存在着汉滩病毒特异的CTL应答。汉滩病毒核蛋白CTL表位的有效预测,大幅度减少了合成候选9肽的数量,降低了成本。为肾综合征出血热细胞免疫应答的研究以及多肽疫苗的设计,奠定了重要基础。

摘要：目的　体外研究汉滩病毒 (HTNV)S基因及其 5’端、3’端表达的意义 ,为核蛋白T细胞表位的研究奠定基础。方法　设计 2套引物 ,用PCR方法从PBV2 2 0 -S2 2原核质粒中扩增出S基因全读码框 (37- 132 6bp)及S基因 5’端 (37-5 0 1bp) ,S基因 3’端 (5 0 2 - 132 6bp)用TA克隆将其克隆入 pcDNA3 1/V5 -His -TOPO载体中 ,成功构建 pcDNA3 1-S及pcDNA3 1-S -N、pcDNA3 1-S -C真核表达载体 ,并通过脂质体转染至Vero -E6细胞中 ,进行了瞬时表达。 结果　间接免疫荧光成功检测到 pcDNA3 1-S及pcDNA3 1-S -N、pcDNA3 1-S -C在Vero -E6细胞中的表达。 结论　pcDNA3 1-S及 pcDNA3 1-S -N、pcDNA3 1-S -C真核表达载体有较高的转染效率 ,目的基因能在宿主细胞中表达 ,有利于研究HTNV -S基因在T细胞表位研究中的意义。

摘要：目的构建含有Toll样受体4(TLR4)基因特异性RNA干扰序列的pSliencer4.1-CMV neo载体,比较其对TLR4的抑制效率。方法通过Ambion公司的在线软件设计TLR4基因(GenBank:NM138554)的RNA干扰(RNAi)序列,按siRNA设计的优化原则筛选靶序列,再选取其中部分序列进行合成,经退火、连接,构建含有TLR4基因特异性RNA干扰序列的pSliencer4.1-CMV neo载体。用脂质体SiPort XP-1分别将载体及阳性和阴性对照质粒转染血管内皮细胞系EVC-304细胞,提取细胞总RNA,进行RT-PCR反应,筛选抑制效率较高的载体。结果共设计出可供选择的序列228条,经BLAST比对后,有30条序列有较好的序列特异性,并根据其在基因中的相对位置选择9条作为siRNA靶序列。RT-PCR结果表明其中有5个载体具有较高的抑制效率,以TS4,TS6,TS8抑制效率最高,分别为89%,90%,88%,其余siRNA的抑制效率均未超过50%。抑制效果较好的5条序列在TLR4基因中的位置分别为444、1203、1389、2774、3409nt处。结论成功构建了抑制效率较高的TLR4基因特异性RNA干扰序列的pSliencer4.1-CMV neo载体,筛选出特异性抑制TLR4表达的序列,为TLR4信号转导的研究奠定了基础。

摘要：目的　探讨乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响 .方法　利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒 C基因的三个单一核酶构建 Rz1核酶自剪切转录载体 (p GEMRz1) ,观察单一核酶 (Rz1)对靶 RNA的切割作用及乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响 .结果　构建的核酶自剪切转录载体体外转录后 ,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来 ,计算机设计的单一核酶体外可剪切靶 RNA;乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切的无明显的抑制或增强作用 ,进一步的结果未观察到乙型肝炎病毒蛋白和靶 RNA的相互作用 .结论　体外转录的核酶可剪切乙肝病毒靶 RNA,在本研究条件下未观察到乙肝病毒蛋白对核酶切割作用的影响 ,从而确保核酶在细胞内能有效发挥作用 .