摘要：[目的]构建针对人线粒体转录终止因子2(mitochondrial transcription termination factor 2,MTERF2)的shRNA干扰表达载体,检测其对人宫颈癌HeLa细胞MTERF2基因表达的干扰效率。[方法]以人MTERF2基因为靶向,设计并合成的2条互补寡核苷酸链克隆至pSilencer^(TM)4.1-CMV neo真核表达载体中得到重组干扰质粒。对重组质粒进行PCR和DNA测序鉴定;运用脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;采用半定量RT-PCR检测2个干扰质粒对人MTERF2基因mRNA表达的干扰效果,并筛选最有效的shRNA干扰序列;采用Western Blot技术检测2个干扰质粒转染HeLa细胞后MTERF2蛋白的表达情况。[结果]经PCR鉴定和DNA测序鉴定证实,pSi-MTERF2-1和pSi-MTERF2-2重组shRNA干扰表达质粒中已插入目的 DNA片断。瞬时转染MTERF2-shRNA的HeLa细胞48 h后,pSi-MTERF2-1和pSi-MTERF2-2干扰表达质粒均可以显著地降低人MTERF2基因mRNA和蛋白质的表达(P<0.01),而且pSiMTERF2-2干扰效果优于pSi-MTERF2-1。pSi-MTERF2-2对MTERF2基因mRNA和蛋白质表达的抑制率分别为74.0%、78.2%。[结论]成功构建针对人MTERF2基因的shRNA真核表达载体有效抑制目的基因的表达,为进一步应用于宫颈癌的基因治疗研究奠定了基础。

摘要：目的:构建人线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达载体,并在mRNA和蛋白质水平对其干扰效率进行验证,以检测和筛选出干扰效率最优的shRNA表达载体。方法:根据人MTERF3基因全长cDNA序列,利用Oligoengine在线软件设计4个shRNA序列,合成4条互补寡核苷酸链,退火成双链后克隆至psiU6.1载体,得到4个重组干扰质粒psi-MTERF3-1～psi-MTERF3-4,并通过PCR和DNA测序对其进行鉴定;将重组干扰质粒利用脂质体介导瞬时转染He La细胞,转染48 h后采用real time RT-PCR检测4个干扰质粒对MTERF3 mRNA表达水平的影响,采用Western印迹检测其对MTERF3蛋白表达水平的情况,并筛选出最有效的shRNA干扰质粒。结果:PCR鉴定和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列;real time RT-PCR和Western印迹结果表明4个重组载体均可以显著降低人MTERF3基因mRNA和蛋白质的表达水平(P<0.05),其中以pSi-MTERF3-4的干扰效率最优,对MTERF3 mRNA表达的抑制率为70.1%,对MTERF3蛋白表达的抑制率为72.2%。结论:在人宫颈癌He La细胞系筛选出有效干扰MTERF3基因表达的shRNA序列,构建了针对MTERF3基因的RNA干扰真核表达载体且能够有效抑制目的基因的表达,为进一步研究人MTERF3在宫颈癌发生发展中的作用机制提供了实验基础。