摘要：【目的】通过CRISPR/Cas9系统对Y染色体多位点切割,实现目标染色体的敲除,为畜禽性别控制提供新的手段。【方法】以CRISPR/Cas9技术为基础,寻找Y染色体上能被sgRNA特异性识别的多拷贝重复序列,并通过体外切割、定量分析、核型鉴定验证其对靶点的有效性。【结果】所设计的sgRNA能够在体外实现对靶片段的明显切割,且切割效率均达到了50%以上。基因的定量分析结果证明了其在细胞水平切割的有效性,且簇状重复序列切割效果明显优于散在重复序列;核型鉴定结果证实了细胞水平猪Y染色体的丢失。【结论】研究结果为后续构建染色体敲除猪,实现猪的性别控制奠定了基础。

摘要：【目的】在哺乳动物中,Toll样受体和抗菌肽基因是先天免疫系统的重要组成部分,在对抗病原体侵袭过程中起至关重要的作用。针对藏猪和杜长大三元猪的Toll样受体和抗菌肽基因在不同免疫器官或组织中的表达差异进行探索,以揭示这些基因对于抗病能力和免疫反应的潜在贡献,为筛选抗病分子标记提供理论支撑。【方法】通过qPCR对6月龄藏猪和杜长大三元猪肺脏、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结和脾脏中Toll样受体基因(TLR1~TLR9)和两种抗菌肽基因(PBD-1和PR-39)的mRNA丰度进行检测。【结果】在藏猪的免疫器官或组织中Toll样受体与抗菌肽基因的m RNA表达大多数显著高于杜长大三元猪。其中,肺脏中TLR1、TLR2的m RNA表达量均提高50%左右,PR-39提高2.6倍;肠系膜淋巴结中TLR4的表达提高40%,TLR1、PR-39的表达分别提高88%和3倍;腹股沟淋巴结中TLR1、TLR2的表达提高约2倍,TLR9、PR-39的表达提高70%,PR-39的表达更是提高了7倍多;颌下淋巴结中TLR1、TLR2、TLR4、TLR7的表达均高出2倍以上,PR-39的表达也高出近7倍,它与腹股沟淋巴结中的水平相近;脾脏中TLR1的表达上升3.5倍,与在颌下淋巴结中的表达结果相似。TLR4、TLR9的表达上升50%左右,PR-39的表达上升2.5倍。【结论】藏猪相对于杜长大三元猪,在多个免疫器官或组织中的Toll样受体和抗菌肽基因表现出更高的表达水平。暗示藏猪可能拥有更强大的先天免疫能力,能够产生更有效的局部或系统免疫反应对抗病原微生物的感染。研究结果为识别抗病分子标记提供了重要的理论支持,有望为进一步改良藏猪和其他猪种的抗病性提供科学依据。

摘要：脂肪组织是动物机体的能量储存站,也是重要的内分泌器官。脂肪过度沉积造成的肥胖会带来一系列的代谢性疾病,如脂肪肝、心血管疾病、胰岛素抵抗等。同样地,猪脂肪的生成影响着猪的抗病力、繁殖性能、肉品质、生产效率等性状,这些性状影响着生猪生产的经济效益。成熟的脂肪细胞是由间充质干细胞经前脂肪细胞分化得到的,这个过程中有许多信号通路和转录因子参与,而自噬通常是分解代谢机体中冗余成分最主要的手段,参与维持着机体内稳态。自噬和脂肪生成之间有密切的联系,通常脂肪生成活跃时伴随着自噬水平的升高;而自噬过程受损也伴随着脂肪生成的抑制。在自噬活动中,有许多相关的转录因子和信号通路也参与调控猪脂肪的生成;而在猪脂肪生成的过程中,许多转录调控因子也与自噬关系密切。作者通过总结最新报道的与自噬调控脂肪生成相关的转录因子和信号通路,阐述自噬参与猪脂肪生成调控的研究进展,为猪营养调控和肉质育种提供了全新的思路和靶点。

摘要：【目的】阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体(STING-sgRNA);以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果,且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株STING基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现STING蛋白,说明STING基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-STING-/-)构建成功。与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05)。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因,而导致STING基因功能丧失;STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍,也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。

摘要：【目的】明确藏猪和杜藏猪(杜洛克父本与藏猪母本杂交F;代)的生长和胴体性状及肉质指标等表型差异,并分析背最长肌中脂肪沉积相关基因的表达差异,为藏猪种质资源利用及猪脂肪沉积规律研究提供参考依据。【方法】以藏猪和杜藏猪为研究对象,分别测定其体长、体高和胸围等生长性状,屠宰率、背膘厚及眼肌面积等胴体性状,以及pH、肉色、蒸煮损失及肌内脂肪含量等肉质指标;并通过荧光实时定量PCR检测脂肪沉积相关基因在2种猪背最长肌中的表达情况。【结果】杜藏猪的左胴体重、右胴体重、屠宰前重、胴体长、体长、体高、管围和胸围均高于藏猪,且差异显著(P0.05,下同);杜藏猪肌肉的pH-24 h、熟肉率、剪切力和含水率显著高于藏猪肌肉,而杜藏猪肉色的a-24 h值(10.30±1.06)和肌内脂肪含量[(2.48±1.44)%]显著低于藏猪。除GHR基因外,其他脂肪沉积相关基因的相对表达量均表现为杜藏猪低于藏猪,其中,ADIPOQ基因和FASN基因的相对表达量显著低于藏猪,IGF1基因、TNFa基因和Leptin基因的相对表达量极显著低于藏猪(P<0.01)。相关分析结果显示,GHR基因相对表达量与杜藏猪肌内脂肪含量呈显著正相关,FASN基因相对表达量与藏猪肌内脂肪含量呈显著正相关,IGF1基因相对表达量与藏猪背膘呈显著负相关。【结论】杜藏猪的肉质性状与藏猪相似,但杜藏猪具有更佳的生长性能,说明以杜洛克为父本与藏猪母本杂交得到的杜藏猪具有更优的生产效率。藏猪和杜藏猪的肌内脂肪含量差异与脂肪沉积相关基因的表达差异有关,即猪的肌内脂肪含量受多种脂肪沉积相关基因调控。