摘要：由于合成生物学的快速发展,目前已经实现了人工设计DNA和蛋白质的合成,对具有重要生物学功能、结构也更为复杂的糖类物质进行精准设计合成,也将是合成生物学未来发展的重要方向。近年来,一种基于细菌寡糖转移酶体系的蛋白多糖偶联技术发展迅速,已被广泛应用于病原细菌多糖结合疫苗的生物合成制备。本文综述了该技术体系中的寡糖转移酶元件、载体蛋白元件、异源多糖抗原合成线路以及工程菌株改造等核心关键模块的最新研究进展。使用生物活体系统,发酵生产多糖结合疫苗,具有产物均一性好、步骤简便、绿色环保等优势,是一种亟待发展的新兴技术,同时也存在一些技术细节需要完善。未来,寡糖转移酶的定向进化、纳米颗粒型蛋白载体的应用、多糖合成基因的组合重排、工程菌株的代谢途径优化,将有望进一步促进多糖结合疫苗的生物合成研究。

摘要：目的 基于分步偶联策略,借助经典的马来酰亚胺-巯基交联反应与异肽键分子黏合方法(SpyTag/SpyCatcher系统),建立抗原与CpG佐剂的定点共价结合技术。方法 设计合成马来酰亚胺修饰的CpG-1018和N端加有半胱氨酸的SpyTag短肽,将二者于20℃振荡孵育以获得中间产物SpyTag-CpG。将SpyCatcher与蛋白抗原Omp19融合表达,通过亲和层析及凝胶过滤层析获得SpyCatcher-Omp19重组蛋白。通过本实验室构建的志贺菌多糖抗原SpyCatcher-OPS糖蛋白表达系统,获得SpyCatcher-OPS糖蛋白。将SpyTag-CpG分别与SpyCatcher-Omp19重组蛋白和SpyCatcher-OPS糖蛋白连接,获得CpG佐剂与抗原共价偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS,经SDS-PAGE分离后,通过荧光分析验证终产物结构。结果 马来酰亚胺和FAM同时标记的CpG-1018和SpyTag连接后,SDS-PAGE检测结果可见对应于SpyTag-CpG交联产物的高相对分子质量条带。马来酰亚胺修饰的CpG-1018与SpyTag连接后,质谱分析结果显示,SpyTag-CpG的相对分子质量与其理论相对分子质量相符合。将中间产物SpyTag-CpG与蛋白抗原SpyCatcher-Omp19、多糖抗原SpyCatcher-OPS孵育连接后,考马斯亮蓝染色和FAM荧光检测均可见对应于终产物CpG-Omp19和CpG-OPS的高相对分子质量条带。结论 成功建立基于分步偶联策略的抗原与CpG佐剂定点共价结合技术,获得了CpG佐剂与两种不同类型抗原的偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS,为未来开发质量可控的自佐剂疫苗奠定了基础。

摘要：目的融合表达百日咳丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)片段FHA1877-2250与志贺毒素B亚单位(Shiga toxin B subunit,StxB)蛋白,并对融合蛋白StxB-Fha1877-2250的免疫保护效果进行评价。方法设计引物将StxB片段连接至FHA1877-2250N-端,构建重组表达质粒pET-28a-FHA1877-2250和pET-28a-StxB-Fha1877-2250,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析和复性后,通过皮下免疫小鼠,共3次,间隔2周。末次免疫后10 d,尾静脉采血,间接ELISA法检测血清抗体效价;血清体外杀菌试验检测杀菌效率;末次免疫后第14天,经腹腔接种2倍半数致死剂量(1.21×108CFU)的百日咳Bp148株菌液,评价动物攻毒保护效果。结果重组表达质粒经菌落PCR和测序证实构建正确。表达的重组蛋白FHA1877-2250、StxB-Fha1877-2250经SDS-PAGE和Western blot分析显示,相对分子质量分别约为43000和51000。StxB-Fha1877-2250免疫小鼠血清抗体效价可达1∶3200。StxB-Fha1877-2250组的血清杀菌效率比FHA1877-2250组略好。以百日咳Bp148菌株攻毒,FHA1877-2250、StxB-Fha1877-2250蛋白对免疫小鼠具有保护力,保护率分别为40%和60%。结论重组融合蛋白StxB-Fha1877-2250相比于FHA1877-2250具有更好的免疫原性和保护效果,为百日咳亚单位疫苗的研究提供了新的思路。

摘要：【目的】构建炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株,为研究eag基因的功能奠定了基础。【方法】本研究以我国人用炭疽杆菌活疫苗A16R株中eag基因为目的缺失基因,根据炭疽芽孢杆菌Ames株基因组序列,利用软件设计了扩增上下游同源臂以及抗性基因引物,构建了重组质粒,将该重组质粒电击转入炭疽杆菌A16R感受态细胞中,利用同源重组原理筛选到炭疽杆菌A16R株eag基因缺失突变株。在分子水平及蛋白质组学方面对基因缺失突变株进行验证。【结果】成功构建了重组质粒,经同源重组后获得eag基因缺失突变株。PCR鉴定表明目的基因已经丢失;SDS PAGE表明野生株与突变株在93 kDa处有差异蛋白条带,经质谱鉴定分析该条带为目的基因所表达的EA1蛋白;双向电泳结果显示突变株与野生株比较明显缺失3个蛋白点,经质谱分析后确定这3个点都是EA1蛋白。【结论】成功获得炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株,为深入研究eag基因的功能奠定了基础,同时也为炭疽芽孢杆菌重要基因功能的研究建立了一个良好的技术平台。

摘要：目的构建炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)A16R株lysA基因缺失突变株,为后续的定量蛋白质组学研究奠定基础。方法以炭疽杆菌活疫苗A16R株lysA基因为目的缺失基因,利用软件设计上下游同源臂以及抗性基因的引物,用同源重组酶将3个片段连入质粒中,构建重组质粒,并将重组质粒导入炭疽杆菌A16R感受态细胞中,筛选炭疽杆菌A16R株lysA基因缺失突变株,对其进行验证。最后绘制缺失突变株和野生株生长曲线并进行生理生化分析。结果成功构建了重组质粒,经同源重组后获得lysA基因缺失突变株。鉴定表明目的基因已经丢失。结论成功获得炭疽杆菌A16R株lysA基因缺失突变株,为定量蛋白质组学研究奠定了基础,也为炭疽杆菌重要基因功能的研究建立了良好的技术平台。

摘要：本文根据大肠杆菌 (E .coli)K12asd基因两侧序列设计了一对引物 ,用全菌PCR扩增了福氏 2aT32株的asd基因及其两侧序列。对PCR产物的初步测序结果表明 ,在asd基因两端存在BamHI位点。为了防止由PCR扩增带来的差错 ,我们又从福氏 2aT32株染色体中克隆了全长的asd基因。序列分析的结果表明 ,福氏 2aT32株asd基因的序列与E .coliK12的完全一致 ,全长 16 80bp ,其两侧序列也与E .coli具有高度的同源性。这为以asd基因作为靶基因构建痢疾菌的载体宿主平衡致死系统创造了条件。

摘要：简并PCR技术是根据同源蛋白的氨基酸序列扩增到同源基因的核苷酸序列,具有独特的优点。成功进行简并PCR的关键是设计好两组引物库和对反应条件进行优化。由于简并PCR自身的特点,在新基因的克隆、基因表达检测、病毒检测和基因组研究中有其广泛而独特的应用。

摘要：【目的】考察炭疽芽胞杆菌中规律成簇的间隔短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)位点多态性情况及基于CRISPR位点多态性的分子分型方法是否在炭疽芽胞杆菌分型中适用。【方法】下载NCBI数据库中6株炭疽芽胞杆菌基因组并截取其中CRISPR位点片段序列。根据炭疽芽胞杆菌内CRISPR位点信息,设计相关引物,以193株炭疽芽胞杆菌基因组为模板PCR扩增CRISPR位点片段,测序。本地Blast比对截取序列及测序结果,查看CRISPR位点在炭疽芽胞杆菌中的多态性情况,并比较炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌内CRISPR位点情况。【结果】炭疽芽胞杆菌内CRISPR位点不存在多态性。【结论】基于CRISPR位点多态性的分子分型方法不适用于炭疽芽胞杆菌分型,但可以用于区分炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌。

摘要：本课题组早期研究结果表明,炭疽芽胞杆菌BA2380蛋白可能与炭疽芽胞杆菌毒力有关,因而有必要对其功能进行深入研究。选取炭疽芽胞杆菌A16D2株为出发菌株,以其BA2380基因为目的缺失基因,参照A16D2株基因组序列及质粒pSET4s序列,利用软件设计上下游同源臂及抗性基因引物,用本实验室改造的"Golden Gate"克隆方法将3个片段同时连入温敏型穿梭载体pKMBK中(本实验室构建的受体质粒),从而构建基因打靶质粒。将该基因打靶质粒导入炭疽芽胞杆菌A16D2感受态细胞中,利用同源重组原理,筛选获得炭疽芽胞杆菌A16D2 BA2380基因缺失突变株,并对其进行验证。结果验证了本课题组构建的"Golden Gate"克隆体系进行多片段克隆的高效性,也为后续探索其基因功能奠定了基础。

摘要：首先用一步法从正常人胚胎肺细胞中提取了细胞总RNA,反转录合成cDNA第一链,再以此为模板,用事先设计并合成的特异引物进行PCR,得到了编码成熟p21的cDNA。插入到pUC18载体中,进行序列分析。测序的结果与国外报道的序列一致。 随后,我们将p21和p53的cDNA分别克隆至真核表达载体pMSCV,该载体含有Neo标记基因和逆转录病毒的LTR启动子。