摘要：为应用液相芯片技术建立同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,在GenBank中收集H5、H7、H9亚型AIV的HA基因序列,利用DNAMAN软件分析比较筛选出特异的保守片段,设计引物和探针。将多重不对称RT-PCR扩增产物与偶联荧光微球的探针进行杂交,建立多重液相芯片方法。结果显示,多重液相芯片技术对H5、H7、H9亚型AIV核酸的最低检出量分别为18.5、28.7、20.7pg/μL,检测的特异性和重复性都很好,应用该方法和禽流感检测试剂盒双盲试验同时对50份已知病毒的样品进行了检测,两者符合率为100%。该方法为禽流感病毒核酸液相芯片的进一步研究奠定了基础。

摘要：为了建立一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒并且能够区分普通毒株和高致病性毒株的荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的国内发表的高致病性PRRSV NSP2基因序列,针对Nsp2缺失区设计一对引物和探针,在结合PRRSV通用检测引物探针进行荧光定量PCR,对反应条件进行优化,用已知PRRSV普通株和高致病性株及其他病毒进行试验。结果表明,该方法可以特异检测并区分高致病性株和普通株。将该方法用于临床标本的检测,通过对32份样本检测,通用阳性为28份,阳性率为87.5%。高致病性株为17份,阳性率为59.38%。表明建立的方法可以用于PRRSV的快速检测,并且可以区分普通株和高致病性株。

摘要：为能快速检测阿胶中驴、马、猪源性成分,建立了三重环介导等温扩增(LAMP)检测方法。针对驴、马、猪线粒体基因的保守区域,设计并筛选出3套LAMP特异性引物。通过优化反应条件,建立三重LAMP方法,将检测为阳性的产物进行酶切法鉴定,判断样本中驴、马或猪源性成分。驴、马和猪的检测限分别为7.9×10^(-3)、1.36×10^(-3)ng和8.5×10^(-2)ng。结果表明该检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高,适合于市场阿胶真伪鉴别与驴、马和猪源性成分的鉴定。

摘要：为建立一种特异性强、灵敏度高、操作简单的猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)检测方法,试验针对MPXV保守区OPG002基因片段设计特异性引物,通过优化环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应体系中内引物、环引物体积及反应温度建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,并应用该方法检测了临床样品和模拟样品。结果表明:建立的MPXV实时荧光LAMP检测方法于64℃恒温反应60 min即可完成DNA检测;该方法能特异性地检出MPXV,最低检出限为25 copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的20倍;该方法对12份临床样品的检测结果均为阴性,可检测出质粒浓度为0.5×10~2~0.5×10~6 copies/μL的模拟阳性样品。说明建立的MPXV荧光LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可用于MPXV的快速鉴别诊断。

摘要：为建立一种快速诊断猴痘病毒(MPXV)的检测方法,根据2022年公布的MPXV的靶基因片段F3L(462 bp,GenBank登录号ON563414)保守区域,设计了1对特异性的引物和1条探针,建立了猴痘病毒荧光定量PCR检测方法。结果显示,本方法仅能有效检测MPXV,与天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒及鼠痘病毒均无交叉反应;对重组质粒标准品的最低检测限为36.5 copies/μL;组内与组间的重复试验变异系数均小于2%;该方法与中国计量科学研究院使用的绝对定量数字PCR方法检测F3L假病毒颗粒的结果一致性达100%。由此表明,本研究中建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性和实用性好,可以用于猴痘病毒的快速鉴别诊断,为口岸进境动物和入境人员的筛查提供了有效的技术手段。

摘要：为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法敏感性高,可检测到最低拷贝数为102拷贝/μL;重复性良好,重复孔Ct值的变异系数均在5%以下;特异性好,除H1和H3亚型SIV外,H4、H5、H7、H9亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒检测均为阴性;在田间样品中成功检出1株H1和1株H3亚型SIV,检出率为1.16%。该方法准确、快速、灵敏、特异,可为H1、H3亚型SIV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。

摘要：作者拟建立检测猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二重液相芯片(xMAP)检测方法,以满足出入境检疫和临床高通量检测的要求。依据GenBank中PPV结构蛋白VP2基因及PCV2全基因序列,设计PPV和PCV2特异性探针、引物及探针互补序列,将探针与磁性微球偶联,对下游引物和探针互补序列标记生物素,采用不对称性二重PCR扩增靶序列,将PCR产物与偶联好的探针进行杂交,用液相芯片仪进行检测。通过对检测条件优化,建立检测PPV、PCV2两种病毒的二重液相芯片技术,并对临床样本进行检测。建立的PPV和PCV2二重液相芯片检测方法,特异性良好,该方法对PPV和PCV2基因拷贝数检测下限分别为1.53×104、2.58×102;对56份临床样品检测表明,该方法与单项PCR检测结果符合率为100%。成功建立了PPV、PCV2二重xMAP检测方法,该检测技术可用于出入境检疫和兽医临床检验。

摘要：本研究旨在建立一种特异性检测牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的LAMP快检方法,以用于该病临床早期诊断与监测。笔者根据LSDV的特异性基因序列,设计了数十套LAMP引物,经过筛选最终确定1套反应效率最高的引物,其位于LSDV095基因序列内。以实验室保存的PUC57-LSDV质粒作为阳性质控进行方法的优化与验证,基于不同的检测需求,分别建立了实时浊度LAMP检测方法、实时荧光LAMP检测方法及荧光可视化LAMP检测方法。优化后的3种LSDV LAMP方法灵敏度均可达20 copies/反应的靶基因,与WOAH推荐的实时荧光PCR方法(5 copies/反应)相近;特异性良好,与山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、赤羽病病毒(AKV)、蓝舌病病毒(BTV)及口蹄疫病毒(FMDV)均无交叉反应。其中,实时浊度法操作程序简单,实时荧光法反应快速(25 min内完成检测),荧光可视化法不依赖专用仪器及中心实验室。将所建方法应用于临床样本的检测,显示这3种方法均可特异性检测到LSDV,与实时荧光PCR方法检测结果一致性为100%,优于WOAH推荐的普通PCR方法。所建方法具有快速、特异、灵敏、操作简便且不依赖专用仪器等优点,可为LSDV的临床快速筛查提供技术支持。

摘要：通过分析比较禽流感病毒H5、H7和H9亚型不同毒株的基因组序列,设计出H5、H7和H9亚型特异性引物与探针,将扩增产物点制在芯片上,分别用H5、H7和H9亚型特异性探针与芯片杂交,研制出用于禽流感病毒H5、H7和H9亚型检测的正向杂交基因芯片,同时对正向基因芯片进行特异性、敏感性试验,并用该方法对待检样品进行了检测。结果表明,禽流感病毒正向基因芯片与新城疫病毒、传支病毒等6种禽类常见病毒无反应,其敏感性高于常规PCR方法。

摘要：为建立饲料用鱼类、哺乳类及禽类源性成分的广谱、快速检测方法,收集Genbank中鳕鱼、鲈鱼、沙丁鱼等鱼类,猪、牛、羊等哺乳类以及鸡、鸭、鹅等禽类的18S rRNA基因序列,分别设计特异性扩增引物和MGB-TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和条件,每种引物探针体系均可以特异性检测目标物种类型而与其他物种无交叉反应。3套引物探针体系组合后可同时检测鱼类、哺乳类及禽类源性成分,三重荧光PCR方法的最低检测限可低至0.002 ng或0.02 ng基因组/反应,变异系数均小于2%。利用建立的三重荧光PCR方法检测35份进境及国产饲料样本,从2份进口饲料及1份国产饲料中检出非标定动物源性成分,结果与行业标准方法的检测结果一致,符合率100%。结果表明,本研究建立的三重荧光PCR方法具有特异性、敏感性高、重复性好等优点,为包括饲料在内的动物产制品源性成分定性分析提供了新的技术分析手段。