摘要：目的　建立聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法 ,并评价其临床应用的价值。方法　依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物 ,用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段 ;对扩得的rpoB基因片段做DNASSCP分析 ,并随机测定rpoB片段的序列。结果　PCR从所有 2 12株结核分枝杆菌中均扩得 2 3 0bp片段 ,13 5份抗酸染色阳性的痰标本中 ,有 113份扩得阳性片段 ( 83 .7% )。在SSCP分析中 ,14 0份经L J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌 ,有 13 0份有rpoB基因突变 (符合率为 92 .9% ) ,72份经L J药敏试验检测为利福平敏感的菌 ,有 67份的rpoB基因无突变 (符合率为 93 .1% )。测序分析发现 5 7份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变 ,10份经SSCP分析为无突变的有 8份无序列改变 ,SSCP与测序结果的符合率为 94 .0 %。在本研究的菌株中 ,耐多药结核病 (MDR TB)占 76.4 % ( 10 7/14 0 ) ,有 92 .5 % ( 99/ 10 7)耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论　建立的PCR SSCP分析方法 ,是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法 ,可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性 ,并可作为MDR

摘要：目的快速检测痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因,了解利福平耐药的分子机制。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物,用PCR方法从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpoB基因片段,对扩增获得的rpoB基因片段进行序列测定,比较分析耐多药、全耐、单耐利福平、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6 h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpoB基因。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测有rpoB基因点突变,突变位点主要为531、516或526常见密码子,且绝大多数为单碱基突变,发现1例MDR-TB出现479位和531位密码子同时突变。敏感株和标准株无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌rpoB基因及其突变,结核分枝杆菌对利福平的耐药性与rpoB基因点突变有关。

摘要：目的应用分子信标探针检测结核杆菌耐异烟肼kat G463condon点突变,并与测序结果比较以验证该检测方法。方法运用软件对Beacon designer设计,katG基因包含463condon的分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法;对扩增产物测序并作比较。结果通过CDC相机观测到结核标准株及耐异烟肼PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;16株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组463condon突变检出率为37%,分子信标检测方法与测序法符合率达93%。结论分子信标技术是一种具有高灵敏核酸点突变检测技术;分子信标芯片检测方法与测序法符合率较好。

摘要：目的分子信标探针在芯片表面的固定结合是限制其在芯片技术领域运用的难题。本研究拟寻找一种将分子信标探针固定在芯片表面的新方法,同时对其中重要影响因素进行优化探讨。方法本实验设计一种带单侧延长臂分子信标探针,固定在芯片表面进行杂交、扫描等后续实验。提高杂交效率部分优化包括:分子信标探针浓度;杂交温度、杂交时间;杂交液配方;4种分子对分子信标荧光信号比较。结果较理想区分阴阳性信号强度理想的探针浓度:Cy3-BDH分子信标探针浓度约10μmol/L,FAM-DABCLYE约15μmol/L。讨论单侧延长臂分子信标特异性高、敏感性高、技术难度低,对中、高密度芯片杂交可做到“点对点杂交”。