摘要：crustin是对虾中重要的抗菌肽,本研究获得的carcinin Pm3属于斑节对虾crustin家族,是一种新型抗菌肽,成熟肽含有92个氨基酸,与其他对虾抗菌肽的同源性小于45%.根据其氨基酸序列和大肠杆菌(Escherichia coli,***)的密码子偏好性设计carcinin Pm3的基因序列,将carcinin Pm3连接到原核表达载体pSmartI-SUMO上,构建重组表达载体p SmartI-SUMO-carcinin Pm3,再转化至原核表达菌株*** BL21(DE3)中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导SUMOcarcinin Pm3的融合表达,进一步优化其表达条件,获得表达量大、可溶性高的重组蛋白.通过亲和层析纯化得到重组蛋白,蛋白的质量浓度达到195μg/m L.利用SUMO酶去除SUMO融合标签,获得没有外源标签的carcinin Pm3抗菌肽,可用于蛋白功能分析、抗体制备等研究.研究结果为carcinin Pm3功能的分析及应用提供参考.

摘要：目的:构建类固醇合成急性调节蛋白(St AR)基因高表达载体,建立St AR基因高表达细胞,研究St AR基因高表达对邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(DEHP)毒性作用的影响。方法:根据Gen Bank提供的St AR基因c DNA序列设计引物,PCR扩增St AR基因并将其克隆到慢病毒载体中,构建St AR基因高表达MCF-7细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot鉴定细胞。用不同剂量DEHP染毒MCF-7细胞和St AR基因高表达MCF-7细胞24 h,检测细胞凋亡相关基因Bax、Caspase-3、Caspase-8在m RNA和蛋白表达水平的变化。结果:基因测序证明构建的St AR基因高表达载体序列正确,荧光定量PCR检测St AR基因转染细胞比正常MCF-7细胞St AR m RNA表达水平升高591.9倍(P<0.01),Western blot实验结果显示,St AR基因转染细胞比正常MCF-7细胞St AR蛋白表达水平升高190%(P<0.01)。不同剂量DEHP染毒St AR基因高表达细胞后,荧光定量PCR结果显示,St AR基因高表达细胞中Bax、Caspase-3和Caspase-8 m RNA表达水平较对照组(0 mmol/L DEHP)显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。Western blot实验显示,St AR基因高表达细胞中Bax、Caspase-3和Caspase-8蛋白表达水平比对照组显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:本实验成功构建了St AR基因高表达细胞,DEHP处理后St AR基因高表达细胞的凋亡相关基因表达水平较MCF-7细胞升高,提示St AR基因具有促进DEHP致细胞凋亡作用。