摘要：目的改进和提高HIV体外扩增检测的灵敏度,缩短检测时间。方法 1)用Broad Institute gRNA设计工具选取HIV的长末端重复序列(LTR)段设计20条gRNA(引导RNA)。2)用含荧光素酶报告的基因HIV(HIV-Luc)感染具有dCas9基因激活系统的Jurkat6465细胞系构建Jurkat6465-Luc细胞系,并将20条gRNA置于Jurkat6465-Luc细胞系中筛选出激活能力筛选,选取效率最高的gRNA-L,gRNA-L与dCas9基因激活系统包装成慢病毒感染Jurkat细胞系,建立可对HIV序列高效扩增的工作细胞系Jurkat6465-L。3)用HIV-Luc感染Jurkat细胞系构建HIV潜伏测试细胞系,设定其潜伏频率为1∶500,并与工作细胞Jurkat6465-L置于细胞培养箱中共同培养7和14 d观察工作细胞对HIV潜伏细胞系的激活能力。4)使用HIV激活剂SAHA和dCas9基因激活系统分别作用于设定潜伏频率为1∶500的潜伏细胞,分别比较对潜伏HIV的激活能力。结果首先,测定荧光素酶活性筛选出的2条具有高效HIV扩增能力的gRNA-L和gRNA-O,二者及对照组促进Jurkat6465-Luc的扩增效力(荧光素酶活性强度)(n=3,pg/mL),6 d分别为:85 530±979.2 vs 96 925±2 759 vs 9 876±437(P<0.01);选取gRNA-L与dCas9基因激活系统构建的Jurkat6465L细胞系作为工作细胞,测试设定潜伏频率为1/500的HIV潜伏测试细胞,在培养7、14 d激活HIV潜伏测试细胞的频率测定分别1/864和1/755,比培养14 d用SAHA激活HIV潜伏模型细胞频率1/1 180更接近设定潜伏频率值1/500;用HIV潜伏细胞测试dCas9基因激活系统激活HIV潜伏细胞频率1/615与对照SAHA激活剂激活HIV潜伏细胞频率1/749相比,更接近于设定频数1/500。结论 dCas9基因激活系统改进HIV体外扩增,可以提高HIV体外扩增检测的效率和灵敏度。

摘要：目的探讨重组酶聚合酶扩增(RPA)结合Cas12a检测输血相关病原体的可行性。方法 1)根据输血相关病原体HIV、HBV、HCV基因组保守区设计、筛选相应Cas12a crRNA。2)据crRNA靶序列区叠瓦状设计RPA巢式扩增内、外侧引物,凝胶电泳法和荧光探针法筛选巢式RPA内、外侧引物。3)通过质粒或病毒模拟标本梯度稀释,将含不同拷贝数或含量的靶序列RPA扩增,扩增产物以Cas12a检测评价RPA结合Cas12a的检测下限。4)用HIV、HBV、HCV相应近源病毒HTLV、WMHBV、HGBV的同源序列的重组质粒来评价所选crRNA的特异性。结果建立起RPA结合Cas12a核酸检测系统,16份重组质粒的检测下限为10 cp,8份EcoHIV病毒模拟标本的检测下限为1 fg,HIV、HBV、HCV 3种重组质粒及RPA扩增产物的交叉检测间未出现错误检出;10例HIV阳性确证标本的检测结果均为阳性。结论 RPA结合Cas12a检测HIV、HBV、HCV核酸是1种检出限和特异性均较好的核酸检测方法。