摘要：目的构建刚地弓形虫(以下简称弓形虫)表面抗原(SAG)1、2 B细胞表位基因片段的原核表达系统,并对其免疫反应性进行分析。方法根据GenBank中已公布的编码弓形虫表面抗原的SAG基因序列,分析SAG1和SAG2基因的B细胞表位,设计并合成弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因,将目的基因与p ET-28a(+)表达质粒连接,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中,挑取完整单个菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中,菌液进行PCR扩增、双酶切和测序鉴定;菌液振荡培养至吸光度(A450值)为0.6~0.8时,加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,得到带有His标签的融合蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE))电泳,对蛋白的可溶性进行分析。使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化,将带有His标签的纯化重组蛋白进行蛋白质印迹(Western blotting)分析和ELISA分析免疫反应性。结果构建的p ET28a(+)-SAG重组质粒,菌液经PCR、双酶切鉴定结果显示,在909 bp处出现特异性目的条带,与预期相符,经测序表明重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE鉴定结果显示,重组蛋白rSAG相对分子质量(Mr)约50 000,为可溶性表达,与预期结果相符。Western blotting分析结果显示,重组蛋白可以与弓形虫感染小鼠阳性血清1∶100发生特异性结合。ELISA检测结果显示,重组蛋白稀释度为1∶1,阳性血清稀释度为1∶50时,阳性反应最明显,A450值为1.037 9。不同稀释倍数的重组蛋白r SAG与不同浓度的小鼠弓形虫阳性血清均可发生反应,并能很好的区分阴性和阳性血清。结论构建了弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因的原核表达系统,重组蛋白rSAG为可溶性表达,并具有较好的免疫反应性。

摘要：目的对猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)Cap蛋白的主要B细胞抗原表位进行分析,构建Cap表达多表位的原核表达系统,并对表达的目的蛋白进行分析,为猪圆环病毒诊断试剂开发奠定基础。方法设计并合成PCV2Cap基因,与PET-28a(+)载体连接后并转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组质粒PET-28(a)-Cap,对重组质粒进行诱导表达获得重组蛋白,通过His亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果重组质粒在大肠杆菌中成功表达,蛋白质分子量约为17.4 k Da,与预期相符;Western blot结果显示,重组蛋白可以与猪圆环病毒阳性血清发生特异性结合。结论PCV2 Cap蛋白的表达纯化为圆环病毒血清抗体诊断方法的建立,进而为养殖场有效监控猪圆环病毒的免疫保护情况奠定基础。