摘要：目的构建针对细胞凋亡抑制蛋白survivin(SVV)基因的特异性RNA干涉载体,并建立稳定转染该干涉载体的人胶质瘤细胞系。方法设计合成针对SVV基因和针对荧火虫荧光素酶(FLF)基因特异性RNA干涉片断,并分别克隆入pSilencer3.1-H1neo载体中,成功构建SVV基因RNA干涉载体pSilencer3.1-SVV和无关序列载体pSilencer3.1-FLF。RNA干涉载体、无关序列载体和空白载体经脂质体法转染胶质瘤细胞系U251,经G418筛选,采用实时定量反转录聚合酶链反应(real-timeRT-PCR)、免疫蛋白印迹(Westernblot)和免疫细胞化学方法分别检测SVV基因在转染细胞中的表达情况。结果酶切鉴定和核苷酸序列分析证实,成功构建了SVV基因RNA干涉载体pSilencer3.1-SVV。获得了稳定转染干涉载体、无关序列载体和空白载体的细胞系分别命名为U251-S、U251-F和U251-P。U251-S细胞中SVV的mRNA和蛋白表达受到明显抑制,U251-F和U251-P细胞中SVV基因表达水平无明显变化。结论SVV基因特异性RNA干涉载体能够明显抑制SVV基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究SVV在胶质瘤细胞系U251中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。

摘要：目的构建针对人Survivin基因的特异性短发卡RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其在人脑胶质母细胞瘤U251细胞中对Survivin基因表达的抑制作用。方法根据SurvivincDNA编码序列,设计并合成针对Survivin基因的特异性RNA干涉片断,将其克隆入pWH1质粒载体,构建Survivin基因shRNA真核表达载体pWH1SR。通过脂质体介导将pWH1SR载体和空载体pWH1分别转染入U251细胞,经G418筛选,建立稳定转染的细胞系U251SR和U251P。采用RTPCR、Westernblot和免疫组化方法检测SurvivinmRNA和蛋白在U251、U251P和U251SR细胞中的表达水平。结果成功构建了Survivin基因shRNA真核表达载体pWH1SR,经酶切鉴定证实克隆正确。获得了稳定转染pWH1SR载体和空载体pWH1的细胞系U251SR和U251P。U251SR细胞SurvivinmRNA和蛋白表达均受到明显抑制,抑制率分别达87%和91%;U251P细胞Survivin基因表达水平无明显变化。结论特异性shRNA能够明显抑制Survivin基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究Survivin在U251细胞中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。