摘要：目的:建立一种多重实时荧光PCR同时检测EPEC、EIEC、EHEC三种致泻性大肠埃希菌和志贺菌的方法。方法:于GenBank数据库中查找三种致泻性大肠埃希菌及志贺菌毒力基因stx1、stx2、eaeA及ipaH基因序列并使用软件进行比对后设计四套引物及探针,建立四重实时荧光PCR检测EPEC、EIEC、EHEC和志贺菌的方法,并对方法反应体系及反应条件进行优化,对方法的特异性、敏感性及重复性进行分析。结果:显示该方法具有检测灵敏度高、特异性强,结果与细菌培养结果完全一致,均为100%。结论:四重实时荧光PCR检测体系可同时检测EPEC、EIEC、EHEC和志贺菌,具有快速、特异性强、灵敏度高等特点,可广泛应用于临床检验、卫生检验、食品检验等领域,对快速有效的实施针对治疗,预防食物中毒,保障公众健康具有重大意义。

摘要：目的:建立一种快速、准确、灵敏的检测肠产毒大肠埃希菌肠毒素基因方法。方法:于GenBank中查找ETEC肠毒素基因lt和st序列并进行比对后设计引物及TaqMan-MGB探针。对引物、探针、Mg2+、TaqDNA聚合酶及dNTPs浓度进行优化,并对方法的灵敏度、特异性、重复性进行分析。结果:建立了双重实时荧光PCR法检测ETEC肠毒素基因lt和st方法。结论:建立了一种灵敏、特异的检测ETEC肠毒素基因的方法。该法在疾病控制相关和临床实验室中具有广泛的实际应用价值。

摘要：目的建立一种检测肠出血型大肠埃希菌(EHEC)产毒基因stx1和stx2的TaqMan双重实时荧光PCR法。方法根据GenBank公布的EHECstx1和stx2基因序列进行比对后设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针报告基团分别使用FAM和HEX标记,淬灭基团使用BHQ1标记。建立双重实时荧光PCR反应体系并对反应条件进行优化,对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。菌液浓度为102～108cuf/ml时,均可观察到扩增曲线,且扩增曲线平滑;检测30份模拟临床样品,均检测到stx1和stx2基因,且均培养出EHEC,该方法灵敏度为100%;3次重复测定108、105、102cfu/ml3个高、中、低浓度的菌液DNA模板,得到其扩增曲线,计算各浓度的Ct值标准差及变异系数,均小于5%,在误差允许范围内。结论建立的双重实时荧光PCR法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。

摘要：目的建立双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法。方法在Gen Bank数据库查找序列并比对后设计tdh和vvh A基因引物和探针。对PCR反应退火温度、引物、探针、Mg2+、Taq DNA聚合酶及d NTPs浓度进行优化,确定反应体系和反应条件,并对新建方法的特异性、灵敏度等方面进行分析,对模拟样品进行检测。结果建立了双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法。该方法的特异性较好,检测限为103 CFU/ml。结论建立的双重荧光PCR方法可快速、灵敏、特异地检测副溶血性弧菌和创伤弧菌。

摘要：目的建立一种快速、特异检测Nam Dinh病毒（NDi V）的实时荧光PCR方法。方法根据Gen Bank和本实验室分离的NDi V进行序列比对,找出保守序列（Rd Rp）并设计特异引物和Taq Man-MGB探针,通过调整引物、探针浓度,优化其反应条件,对方法做灵敏度、特异性、稳定性实验,以评价反应体系。结果 NDi V的Taq Man-MGB实时荧光PCR检测方法用时短,灵敏度高,最低检测下限为0.1 PFU。与登革热1-4血清型病毒、流行性乙型脑炎、人呼吸道合胞病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒无交叉反应,特异性良好;将4份核酸含量不同的标准样品重复检测5次,平均Ct值变异系数范围为1.67%-3.68%,稳定性较高。通过监测,龙岗区蚊虫携带NDi V概率为18.00%。结论NDi V的Taq Man-MGB实时荧光PCR方法是一种快速、特异、灵敏、稳定性好的方法,可应用于流行病学环境监测,提高病毒的快速检测能力。