摘要：【目的】鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是对家禽危害最大的两种支原体,MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节。通过将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立一种操作便捷、反应快速、结果可视化、可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法。【方法】基于MG的mgc2基因、MS的vlhA基因设计特异性引物和探针,优化反应时间、反应温度及引物配比建立双重LFD-RPA快速检测方法,评价其灵敏度、特异性、稳定性,同时对120份临床样品进行检测。【结果】双重LFD-RPA检测方法在37℃下反应5-10min即可完成扩增,其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1最佳引物配比为0.6∶1.4。MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46 copies/μL。用该方法与OIE推荐的PCR方法对120份样品进行检测,二者符合率为93.3%。【结论】MG、MS双重LFD-RPA检测方法在恒温条件下即可完成扩增,其操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好,无需使用任何仪器即可观察到结果,适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的现场快速检测。

摘要：鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)是对家禽危害最大的两种支原体,本研究拟建立基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的MG、MS双重检测方法。以MG的mgc2基因、MS的vlhA基因为检测靶标设计数对引物,通过筛选得到最佳引物,优化反应时间和反应温度以确定最佳反应条件,通过优化MG、MS最佳引物配比确定双重基础RPA的反应体系,并进行灵敏度、特异性、重复性试验,用所建方法对120份临床样品进行检测。结果显示,建立的MG、MS双重基础RPA检测方法在37℃下反应20 min即可完成扩增,其最佳引物配比为0.6∶1.4。以重组质粒为模板时,MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46copies/μL;以基因组DNA为模板时,MG、MS的最低检出限分别为1.23×10^(-3)ng/μL、5.68×10^(-3)ng/μL。该方法具有良好的特异性和稳定性。分别用该方法与OIE推荐的单重PCR方法检测120份临床样品,结果表明,该方法的检出率高于OIE的PCR方法,与OIE的PCR方法一致性较强。上述结果表明,建立的MG、MS双重基础RPA检测方法具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好的优点,可实现临床MG、MS感染的鉴别诊断。

摘要：为建立一种对牛支原体高效、快捷的可视化重组酶聚合酶扩增(LFD-RPA)临床诊断方法,以牛支原体uvrc基因序列为靶基因,设计特异性引物和探针,通过筛选引物和探针、优化反应条件,并通过灵敏度、特异性、重复性和临床样本检测试验进行验证。结果显示,该试验建立的牛支原体LFD-RPA最佳引物为F2/R2,最佳反应条件为39℃、 25 min;检测灵敏度可达2.08 copies·μL^(-1),是普通PCR灵敏度的100倍;与滑液囊支原体、沙门氏菌、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和产气荚膜梭菌之间无交叉反应;重复性稳定;对50份鼻拭子样本进行检测,阳性率为26%,与我国行业标准PCR检测方法的符合率为89.6%。该试验成功建立了牛支原体LFD-RPA检测方法,该方法具有操作简便、快速、高效、敏感等优点,为牛支原体的临床快速诊断提供了技术支撑。