摘要：根据文献设计2对引物,PCR扩增FPV复制非必需区中外源基因插入位点两侧翼的片段,分别克隆到pUC19和pSK质粒中,并命名为pFP1和pFP2。根据文献设计引物,PCR扩增鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因的编码区。将GB基因克隆到质粒pFP1中获得重组质粒pFP1-GB;用酶切质粒pEGFP,得到GFP片段并克隆到质粒pFP2中,得到重组质粒pFP2-GFP。双酶切pFP1-GB得到FP1-GB片段,并克隆到质粒pFP2-GFP中,得到重组质粒pFP1GB-FP2GPF。酶切质粒pE/L-7.5,获得背向连接的2个鸡痘病毒启动子片段——PE/L-7.5,并将该片段克隆到重组质粒pFP1GB-FP2GPF获得重组质粒pGB-GFP,该质粒即为鸡痘病毒的转移质粒。在质粒pGB-GFP中,2个背向连接的启动子被克隆到的GB和GFP基因之间,分别启动GB和GFP基因的表达。经酶切和测序鉴定pGB-GFP,启动子PE/L和P7.5已分别正确地插入到GB和GFP基因之间,分别启动外源表达基因GB和筛选标记基因GFP的表达,从而证明已获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体pGB-GFP。该载体为下一步获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因的重组鸡痘病毒奠定基础。

摘要：应用荧光定量PCR技术,根据兔病毒性出血症病毒的保守基因VP60设计了1对引物和1段Taqman MGB探针,建立了用于检测兔病毒性出血症病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。试验中能够检出的RHDV VP60基因质粒拷贝数达103数量级,能够检测到RHDV病毒核酸最低量可以达到5 pg,未检出其他病原的RNA。试验结果表明,建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量RT-PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的兔病毒性出血症病毒,适合于兔各脏器及肌肉组织中兔病毒性出血症病毒的快速诊断和检测。

摘要：为了解山东省仔猪病毒性腹泻的流行状况,本研究根据Gen Bank中登录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRo V）序列,分别设计扩增引物,采用RT-PCR方法对2013年10月～2014年10月采集的226份腹泻样品进行检测。结果显示226份病料样品中,PEDV、TGEV及PRo V的阳性率分别为34.96%、2.21%及28.76%,并且不同季节PEDV和PRo V均有感染,表明PEDV和PRo V是引起山东省仔猪腹泻的主要病原,并且山东省PRo V的感染率明显高于全国。规模化猪场与散养户相比,PEDV、TGEV及PRo V 3种病原的检出率明显降低,而且相对于未免疫腹泻二联苗的母猪,免疫母猪生产的仔猪发生腹泻后,该病原的检出率有所降低,表明合理的饲养环境和免疫对该病具有有效的防控作用。

摘要：参考GenBank上发表的H5亚型禽流感(AIV)血凝素(HA)基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18基因的2对引物。然后分别以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFast-BacTMdual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTMdu-al的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组pFastBacTMdual-HA1-mChIL-18真核表达质粒。最后将构建的真核表达质粒转座入大肠杆菌DH10Bac,并利用昆虫细胞进行转染。这个重组载体的构建为考察mChIL-18作为免疫增强剂的作用及下一步AIV疫苗的研究奠定了坚实的基础。

摘要：为建立猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的鉴别检测方法,本研究根据CSFV Npro基因、BVDV 5'-UTR基因保守区域设计特异性引物和Taq Man探针,构建阳性重组质粒,优化反应条件,建立了双重RT-q PCR检测方法。该方法 CSFV和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对206份猪病料进行检测,CSFV阳性59份、BVDV皆为阴性,与本实验室常用单项RT-q PCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重RT-q PCR整个检测过程不到3 h,采取闭管反应,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点,可用于CSFV和BVDV的临床鉴别检测,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。

摘要：依据Gen Bank中大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的部分已知序列,选取大肠杆菌的uid A基因、肺炎克雷伯氏菌的khe基因和不动杆菌的sec E基因,利用Primer Premier 5设计引物,选出扩增序列的3对引物及相应的Taqman探针,uidA、khe、secE探针5'端分别标记FAM、HEX、CY5荧光发射基因,3'端标记BHQ1淬灭荧光基因。通过优化反应条件,建立一种同时检测大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的诊断方法。特异性和敏感性试验显示,该方法能特异地检测大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌,其最低检测限分别为2×10^(-1) CFU/μL、9.2×10^(-1) CFU/μL和4.3×10^(-1) CFU/μL。整个检测扩增在2小时内完成。该结果表明本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的灵敏度、重复性及特异性均较好,可用于同时快速检测三种病原菌。

摘要：本文参照NDV融合蛋白(F)基因序列设计引物,通过一步法RT-PCR扩增到NDV强毒株的170bp大小的特异条带。试验中未检出NDV弱毒株、IBV、AIV、IBDV的RNA,能够检出NDV尿囊液毒的最低滴度为10-5稀释度(相当于103.7EID50病毒量)。对山东省不同地区于1997至2003年所分离的21个NDV强毒株检测全为阳性,而6个NDV弱毒株全为阴性。整个实验操作从病毒核酸提取到判定结果,在5h内即可完成。实验结果表明,该方法特异、敏感。

摘要：为了解山东省猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行情况,本研究采用RT-PCR的方法对2012年1月~2016年12月山东省13个地市采集的258份疑似PEDV感染样品进行检测,并设计引物扩增PEDV ORF3基因片段,通过生物信息学软件对26个具有代表性的完整的PEDV ORF3基因序列进行遗传进化分析。结果显示PEDV平均每年检出率达72.1%,表明PEDV是当前山东地区仔猪腹泻的主要致病病原。遗传进化分析显示,26株PEDV ORF3基因序列属于G2基因型,与其它参考PEDV病毒株同源性较高(93.8%~100%),相对保守。其中3株PEDV流行株位于2a亚型中,这在华北地区属首次报道。PEDV 2a亚型基因序列具有特异位点突变,可作为鉴别2a亚型与其它亚型的分子标记。本研究揭示了山东省PEDV流行株ORF3基因的主要基因型,为该省PEDV的防控提供依据。

摘要：参考GenBank上发表的H5亚型禽流感(AIV)血凝素(HA)基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18的cDNA的2对引物。然后以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBacTM dual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTM dual的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组pFastBacTM dualH-A1-mChIL-18真核表达质粒。最后将构建的真核表达质粒转座入大肠杆菌DH10Bac,为下一步进行昆虫细胞的转染奠定了基础。这个重组载体的构建为考察mChIL-18作为免疫增强剂的作用及下一步AIV疫苗的研究奠定了坚实的基础。

摘要：为了解山东省毛皮动物(水貂、狐狸和貉子)养殖场户生物安全措施实施情况,采用电子问卷调查法,从养殖场户基本信息、场内分区情况、饲料种类、防疫措施、消毒措施、饲养管理(饮水、繁殖、免疫等)等方面进行问卷调查。本次调查回收有效问卷105份,涉及种用场、商品代场、散养户;被调查场户中,仅53.3%能做到办公区、生产区、生活区分开管理;以自配饲料为主,禽产品和海产品是主要饲料原料;大部分场户有全场消毒意识,但具体措施不完善;对动物胴体的无害化处理意识淡薄。调查表明,山东省毛皮动物养殖场户的生物安全意识较高,但是认识还不全面,在场区设计、消毒以及饲养管理、无害化处理等方面还存在一些安全漏洞。因此,毛皮动物养殖场户须加强生物安全控制,进一步提高对生物安全相关技术的认识。