摘要：【目的】烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^+)在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞生命周期中具有重要的作用,其细胞内含量是能量效率的关键因素。强化辅因子合成策略,获得高产NAD^+菌株,对于NAD^+依赖型氧化还原反应的速率和调节相关生化合成途径的代谢流具有重要意义。【方法】首先通过内源性调节,对代谢途径中的关键酶基因进行强化,过量表达和共表达NAD^+合成途径中的关键酶基因pncB、nadD和nadE;其次,通过外源调节增加NAD^+前体物,优化诱导条件提高发酵过程中关键酶的表达量,增加NAD^+的合成量;最后在单因素优化试验的基础上,以NAD^+含量为响应值,采用Box-Bohnken试验设计方法,研究3个显著性影响因素相互作用对NAD^+积累量的影响,确定最佳的优化条件。【结果】根据关键酶基因强化策略,构建了7株重组菌,其中重组菌*** BL21/p ET-21a-nad E-pncB胞内NAD^+含量相比初始菌株*** BL21/pET-21a提高了405.2%。通过对该菌株诱导条件和NAD^+合成前体的优化,使用Design Expert 8.0分析实验数据,得出该重组菌株的最佳发酵条件为:诱导温度控制在15–20 oC,OD_(600)为0.6–0.8时添加IPTG 0.63 mmol/L、烟酸15.8 mg/L、诱导时长控制在24 h。NAD^+含量在最优条件下实验验证值可达43.16μmol/g DCW,与优化前相比提高了123.6%,与初始菌株相比提高了1029.8%。【结论】在大肠杆菌中共表达关键酶基因pncB和nadE,胞内NAD^+合成量明显增加,前体物以及诱导条件的外源调节使NAD^+积累量达到最佳优化值。实现了提高NAD^+含量的目标,胞内辅因子浓度的增加为提高生物催化效率奠定了可行性基础。

摘要：以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等为代表的典型模式微生物是合成生物学研究中的重要底盘细胞。典型模型微生物的新型基因表达调控工具开发与应用实现了细胞代谢途径的精确工程设计和新型遗传回路的设计,极大促进了合成生物学和代谢工程的发展。本文针对典型模式微生物基因表达精细调控工具,特别是人工基因表达调控元件和精确调控的工具进行了系统总结和讨论。首先总结了经典的基因表达调控元件,然后介绍和讨论了基于中心法则创建的新型基因表达调控元件、基于全局调控蛋白的基因表达全局调控工具,以及响应特定信号的基因表达调控工具三个方面的最新研究进展,最后展望了如何通过新型天然基因表达调控元件的发现和响应代谢压力等细胞生理特性的基因表达调控系统的开发,进一步提升基因表达精细调控的范围和精度。通过将系统生物学数据与生物信息学相结合,能够进一步促进基因表达调控元件的标准化和多元化,提升基因表达精细调控的效率。