摘要：为了调查兰州地区肺炎患儿中RSV和HPIV-3的感染状况,分别在RSV的G蛋白基因的保守序列和HPIV-3的HN基因的保守序列处,设计了套式引物,采用套式RT-PCR的方法检测了60份兰州地区肺炎患儿下呼吸道分泌物样本,结果显示,60份样本中RSV阳性为14例(23%),HPIV-3阳性为12例(20%)。并分别随机对其中的5份样本的扩增产物进行了基因序列测定,结果5份RSV阳性样本与参考株序列的同源性均大于97%,5份HPIV-3阳性样本与参考株序列的同源性大于97%。表明兰州地区下呼吸道感染患儿中,RSV和HPIV-3是常见的感染病原体。

摘要：目的用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac■baculovirus expression systems, Bac-to-Bac BES)表达人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3, HPIV-3)的重组融合蛋白(fusion protein, F),并研究密码子优化、疏水性区域、SUMOStar融合标签及gp67分泌信号肽对目的蛋白表达的影响,同时研究F蛋白的抗原性与免疫原性。方法全基因合成HPIV-3 F蛋白昆虫细胞密码子优化基因序列,设计特异性引物,经PCR扩增获得HPIV-3全长优化型F基因(op-F)、去除N端和C端疏水区域的截短优化型F基因(opt-F)和截短野生型F基因(wtt-F);将以上基因分别构建至pFastBac1、pI-SUMOStar、pI-secSUMOStar 3种载体,采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对各目的基因对应的蛋白进行表达。利用SDS-PAGE、Western blot等方法对各目的蛋白的表达及特异性进行检测。用纯化的重组opt-F蛋白免疫青紫蓝兔,制备F蛋白特异性抗体。结果 ①对HPIV-3的opt-F基因及wtt-F基因的表达对比显示,opt-F基因在3种载体中都得到了良好表达,而wtt-F基因在3种载体中均未表达,说明密码子优化对目的基因的表达具有重要作用;②对HPIV-3的op-F基因及opt-F基因在pFastBac1载体中的表达对比显示,opt-F基因得到了良好表达,而op-F基因未表达,说明疏水性区域可显著影响目的基因的表达;③对HPIV-3的opt-F基因在pFastBac1及pI-SUMOStar载体中的表达对比显示,SUMOStar融合标签可使opt-F基因的表达量明显提高;④对HPIV-3的opt-F基因在pI-SUMOStar及pI-secSUMOStar载体中的表达研究显示,添加gp67分泌信号肽后未检测到opt-F基因的可溶性表达,说明gp67信号肽对目的蛋白无促可溶性表达效果。⑤纯化的opt-F/pI-SUMOStar蛋白免疫青紫蓝兔,得到了滴度为1∶8 192的抗血清。Western blot显示,此血清可以特异性结合HPIV-3病毒的F蛋白。结论密码子优化、N/C端疏水区域的去除以及SUMOStar融合标签的嵌合,可以显著提高F蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达。

摘要：目的建立3种用于检测G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因的一步法实时逆转录PCR,用于本实验室G1、G2和G4型轮状病毒的快速检测和定量、定性分析。方法设计G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因特异性引物和探针,采用G1、G2和G4型轮状病毒特异性体外转录RNAs,建立实时逆转录PCR,特异性检测G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因方法。结果 3种实时逆转录PCR标准曲线R^2均大于0.99,扩增效率均在90%～110%之间。不同浓度体外转录RNAs重复性检测结果 CV均<5%,且可以对单拷贝RNAs样本进行检测。结论本检测方法快速、灵敏且重复性好,可以对轮状病毒VP7基因进行特异而有效的检测,为实验室轮状病毒毒株的分型和定量检测提供了特异而有效的检测方法,也为今后多重实时逆转录PCR的建立奠定了试验基础。

摘要：目的利用TaqMan实时荧光RT-PCR(real-time RT-PCR)技术建立测定人3型副流感病毒培养物滴度的方法。方法根据人3型副流感病毒HN基因的保守序列设计引物及探针,采用10倍系列稀释的体外转录HN RNA为模板,建立定量标准曲线。验证方法的专属性、敏感性、重复性,并对人3型副流感病毒的病毒培养液滴度进行检测。结果建立的方法对HN RNA标准品的检出灵敏度为4.7 copies/μL,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为105%。标准品的实验内重复性CV均<0.50%,实验间重复性CV<3.60%。系列稀释HNRNA标准品在低温(-80℃)下保存3年后,所测标准曲线的斜率和截距差异均无统计学意义(P=0.673)。用该方法对人3型副流感病毒分离株LZ17、LZ1501和LZ1728进行检测,结果均为阳性,3个病毒分离株滴度检测重复性CV均<10.00%;对7种呼吸道非人3型副流感病毒病原体检测均为阴性,表明该方法具有很高的专属性、敏感性和重复性。结论建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地对人3型副流感病毒滴度进行检测。

摘要：目的:对多重实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)进行反应体系筛选和方法探索,使其用于G1—G4型轮状病毒VP7基因的快速分型和定量分析。方法:设计G1—G4型轮状病毒VP7基因特异性引物和探针,以特异性体外转录RNA为模板,筛选多重qPCR反应体系,建立多重qPCR方法。采用单因素方差分析和配对样本t检验对多重与单重qPCR检测结果进行比较。结果:经筛选,得到6组三重qPCR反应体系和1组四重qPCR反应体系。所建立的三重和四重qPCR中,除四重qPCR的G1型参数〔标准曲线决定系数(R2)为0.982、扩增效率为89.221%〕略低于要求外,其余标准曲线R2均>0.99,扩增效率均在90%至110%之间;检测灵敏度达102拷贝/μl。多重与单重qPCR检测同一样本的相关性较好(R2>0.95)。三重与单重qPCR(t值为1.420~25.786)、四重与单重qPCR(t值为2.505~4.851)检测结果间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论:建立的多重qPCR可同时对3种以上目的基因进行分型和定量检测,为未来多价轮状病毒疫苗及混合病毒样本中毒株的快速分型和定量检测方法的建立提供了借鉴。