摘要：目的　通过病例对比 ,进一步研究 TTV是否有致病性 ;对 1例西安地区非甲 -非戊型肝炎但血清 TTV阳性患者套式 PCR终产物纯化测序 ,在验证我们 TTV DNA检测正确性的同时初步研究西安地区 TTV流行株部分分子生物学特点 .方法　在 TTV ORF1区参照文献 [1]设计一套套式 PCR引物 ,并建立稳定的套式 PCR检测法 ,对西安地区 119例非甲 -非戊型肝炎患者及 16 2例健康有偿献血员进行 TTV对比检测和统计学处理 ;对 1例患者套式 PCR终产物纯化测序 ,用 DNAsis软件在计算机上与中国 1株做同源性比较阳性 .结果　 119例非甲 -非戊型肝炎患者中 37例 TTV DNA阳性 ,阳性率 31.1% ;16 2例健康有偿献血员中 TTV DNA阳性 30例 ,阳性率 18.5 % ;两组有明显的统计学差异 (P30 .0 % ) .其中6 2 bp序列同源性高达 75 .8% .结论　 TTV可能有致病性 ;西安地区可能存在新的

摘要：目的　丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 3 (NS3 )是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因 ,我们应用微矩阵 (microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法　根据HCV H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV H株cDNA的pBRTM 3 0 11质粒DNA作为模板 ,进行多聚酶链反应 (PCR)扩增 ,获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 .1(-) NS3。以pcDNA3 .1(-) NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总RNA ,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 (bioinformatics) ,克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果　构建了真核表达载体pcDNA3 .1(-) NS3 ,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3 .1(-) NS3转染HepG2后提取总RNA ,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因 ,命名为NS3TP6,新基因的编码基因序列全长为 414个核苷酸 (nt) ,编码产物由 13 8个氨基酸残基 (aa)组成。

摘要：目的　探讨 RT- PCR用于 HFRS临床标本中病毒基因检测的若干影响因素及西安地区近年主要流行汉坦病毒(HV)毒株的分子流行病学特点 .方法　设计合成了两套分别互补于 HV M基因片段和 S基因片段的引物 ,建立了检测HFRS患者临床血清标本中 HV基因的 RT- nested PCR方法 ,并对扩增的部分 HV靶基因进行了测序分析和比较 .结果　 119份 HFRS患者血清 (经临床和 IFA确诊 )经用 S基因片段引物的 RT- nested PCR检测 ,阳性率分别为 :6 0 .5 %(3wk ) ,31份 HFRS急性期患者血清用 M基因片段引物的RT- nested PCR检测 ,仅 12份阳性 ,阳性率 40 .0 % .将 PCR扩增的 6个靶基因序列与 76～ 118株 S基因片段相应的核苷酸序列进行分析比较 ,同源性为 87.2 %～ 96 .0 % ;其推导的氨基酸序列与 76～ 118株核衣壳蛋白相应的氨基酸序列比较 ,同源性为 89.0 %～ 96 .0 % .结论　 S基因片段引物的PCR扩增效果优于 M基因片段引物 .6份 S基因片段引物扩增产物的测序结果显示 ,西安地区引起

摘要：目的评价基于载体的靶向乙型肝炎病毒(HBV)C基因的小发卡RNA(shRNA)对耐拉米夫定HBV的抑制作用,探讨新的抗病毒治疗手段。方法从临床耐拉米夫定患儿中提取耐药HBV基因组,经高保真重复延伸及序列拼接后测序,纯化并克隆到pGEM-T Easy TA载体,再经酶切消化,连接入pcDNA3.1载体,构建表达耐药HBV的表达载体pcDNA-HBV-1;根据GenBank收录HepG2细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV C基因区的3条siRNA的表达载体pSilencer4.1/HBV-C1,C2,C3。经退火连接入pSilencer-CMV4.1载体。中量超纯提取质粒,定量后与转染试剂siPort XP-1及pcDNA-HBV-1共转染人肝癌细胞系HepG2细胞。分别设立正常HepG2组(未转染组)、载体阴性对照组及共转染组。在共转染后的不同时间点,应用Western blot检测细胞中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)蛋白、乙肝病毒e抗原(HBeAg)蛋白的表达;应用实时荧光定量PCR定量检测细胞上清中HBV DNA拷贝的变化。结果构建的耐药HBV表达载体用于转染HepG2细胞,在转染后的第7天至下次传代前该细胞中可检测到稳定表达的HBV DNA,HBsAg、HBeAg可检出。Western blot结果:在转染的第3天载体pSilencer4.1/HBV-C1、pSilencer4.1/HBV-C2、pSilencer4.1/HBV-C3均可抑制HBV的复制与表达,其中pSilencer4.1/HBV-C2抑制效应尤其显著,在转染后第3天对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为(83.53±0.48)%、(86.12±0.83)%。定量PCR检测显示特异性siRNA可以显著抑制HBV-DNA,可以使DNA拷贝数降低102个数量级。结论基于载体的特异性siRNA在体外可抑制HepG2细胞中耐药HBV的复制和表达。该特异性siRNA可作为耐拉米夫定HBV的一种有效的基因治疗措施。

摘要：目的筛选汉坦病毒β3整合素受体拮抗肽，为进一步设计和获取高活性的抗病毒短肽提供参考资料。方法以郎整合素为靶分子，从随机七肽噬菌体展示库中筛选β3整合素的高亲和力噬菌体配体，应用相关软件对阳性噬菌体的基因DNA测序结果进行分析。结果通过比较亲和性噬菌体外源插入肽的DNA序列，发现LPLTPLP、TGVKGPG、DHRNHLV肽段有较高的重复概率，经与汉滩病毒囊膜糖蛋白氨基酸序列比较发现，两者存在一定的同源序列。结论运用噬菌体展示技术从肽库中筛选邸整合素受体拮抗剂是可行的。

摘要：目的:构建介导大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法:以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果:CTGF的短发夹RNA(shRNA)片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论:构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。

摘要：目的了解基于载体的siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用,观察特异性siRNA载体对细胞的毒副作用及可能的非靶向效应,探讨新的抗病毒治疗手段。方法根据GenBank收录HepG2.2.15细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV的C基因区的3条siRNA的双链复合体,经退火连接入p-Silencer-Cmv4.1载体,连接产物转化JM109细胞,载体经聚丙烯酰胺凝胶电泳及测序鉴定后中量超纯提取质粒,定量后与转染试剂siPort XP-1转染HepG2.2.15细胞。免疫荧光及Western blot检测病毒蛋白HBsAg、HBeAg的表达;RT-PCR检测HBV RNA的表达变化;Real-time PCR定量检测HBV DNA拷贝变化。同时采用MTT法检测细胞的生长曲线与生长率。ELISA法检测IFN-α的表达变化。结果Western Blot结果显示在转染第3天p-C2对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为(81.15±0.69)%、(88.12±0.92)%,免疫荧光显示同样结果。RT-PCR检测结果显示C基因特异的表达性siRNA可以显著抑制HBV的mRNA表达,对C区HBV mRNA的抑制达96.9%。定量PCR检测显示特异性siRNA使HBV DNA拷贝数降低102个数量级。而MTT检测表明该特异性siRNA表达载体不影响细胞的生长曲线与生长率,治疗组与对照组比较无差异。ELISA法检测表明特异性siRNA并不影响细胞干扰素的表达,p-C1、p-C2、p-C3组与未转染组、p-NC组比较表达均无差异。结论基于载体的特异性siRNA在体外可抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达。该抑制作用是特异性的,同时对细胞无明显毒副作用。该作用为基因水平的裂解作用,不会出现耐药现象。

摘要：目的 :研究西安地区TTV(Transfusiontransmittedvirus)基因组结构是否为环状 ;对西安地区TTVDNA部分序列直接测序分析 ,比较其与中国 1株同源性。方法 :自行在TTV基因组首尾端设计一套环形检测引物 ,检测西安地区肝炎患者TTVDNA阳性血清 ,有无特异性片段。参照文献设计一套套式检测引物 ,内引物扩增片段长为 197bp ,将 197bp处特异性条带从低熔点凝胶中切下 ,纯化后以自带引物直接测序法测序 ,测得的 143bp序列与Genebank注册的BDH1同源性比较。结果 :环形引物套式PCR扩增在 30 0bp处出现特异性条带 ,提示西安地区TTV毒株可能首尾相连。西安地区TTV毒株与BDH1同源性为 6 5 .0 % ,差异率 35 .0 % (>30 % ) ;143bp中的 6 2bp序列与BDH1同源性达 75 .8%。结论 :西安地区TTVDNA结构可能有环形株存在 。

摘要：目的　调查西安地区不同类型肝炎患者输血传播病毒 (TTV)感染状况并探讨其临床意义 .方法　在病毒 ORF1区设计内 /外两对引物 ,采取 nested- PCR方法 ,检测病毒性肝炎患者 147例和非病毒性肝炎患者 12 8例血清中 TTVDNA.结果　在肝炎组中 ,TTV基因检测阳性率分别为非甲-非戊型肝炎 6 0 .0 % (9/ 15 ) ,庚型肝炎 5 0 .0 % (6 / 12 ) ,乙型肝炎 2 6 .2 % (2 1/ 80 ) ,丙型肝炎 11.1% (3/ 2 7) ,甲型肝炎 0 (0 /6 ) ,甲型肝炎合并丙型肝炎 0 (0 / 2 ) ,乙型肝炎合并丙型肝炎为 6 0 .0 % (3/ 5 ) ,非肝炎对照组 2 .3% (3/ 12 8) .结论　西安地区不同类型肝炎患者中 ,除甲肝和甲肝合并丙肝外均有 TTV重叠感染 ,其中以非甲 -非戊型肝炎和庚型肝炎最高 .从以上结果推断

摘要：目的:构建针对小鼠Toll样受体4(TLR4)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,体外评价对RAW264.7细胞TLR4mRNA及蛋白水平的抑制效果;观察对TNF-α,MIP-2水平及p38-MAPK,ERK1/2磷酸化水平的影响.方法:根据siRNA设计原则并经BLAST比对,设计合成7条siRNA双链复合体,体外退火后在T4连接酶作用下连接入重组载体pSilen-cerTM4.1-CMV neo plasmid,连接产物转化JMl09感受态细胞,筛选阳性克隆并提取重组体,行HindⅢ及BamHⅠ双酶切,酶切产物经聚丙稀酰胺凝胶电泳确定插入片段,测序鉴定;RT-PCR检测TLR4mRNA水平变化,间接免疫荧光及Western Blot检测TLR4蛋白水平变化;用LPS刺激转染细胞,观察TNF-α及MIP-2水平的变化,Western Blot检测p38-MAPK及ERK1/2磷酸化水平的变化.结果:双酶切及测序证实重组载体构建成功;体外实验表明,RAW264.7细胞中TLR4mRNA及蛋白水平均降低;TLR4siRNA抑制LPS对TNF-α及MIP-2表达的上调作用,LPS对p38-MAPK及ERK1/2的活化作用亦被TLR4siRNA下调.结论:TLR4siRNA表达载体在体外可下调RAW264.7细胞的TLR4表达,抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α及MIP-2的分泌有抑制作用,TLR4siRNA可望作为调控LPS信号通路的一个有效工具.