摘要：目的了解北京市甲型H1N1流行性感冒（简称流感）轻症与重症患者流感病毒的全基因组特性。方法选取北京市甲型H1Nl流感检测网络实验室于2009年6—12月在北京市定点医院采集的流感病例咽拭子标本作为研究对象，共21份，包括重症病例标本10份（其中有4份标本来源于死亡病例），轻症病例标本11份。由咽拭子标本中提取病毒核酸，设计基因组全长扩增引物，病毒核酸逆转录后进行PCR，对PCR产物测序，通过序列分析软件，分析病毒各基因进化和氨基酸变异情况。结果2009年北京市流行的甲型川Nl流感病毒8个基因节段与疫苗株A／California／07／2009（HlNl）相比，核苷酸同源性高达99％以上，未发生较大变异，其中，血凝素蛋白（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）基因的遗传距离相对较长，分别为0．0050，0．0040，0．0040；HA基因的P83S、1321V，NA基因的N248D，多聚酶（PA）基因的P224S，NP基因的V100I、L122Q变异在所有样本中均发生。重症病例的HA、NA、M、朋、多聚酶（PB2）、非结构蛋白（NS）基因具有明显基因进化聚集性；HA基因的S128P和$203T、PA基因的R269K和D547E、PB2基因的T588I、NS基因的1123V变异主要发生在重症病例中，分别有6、9、6、7、9、6例；其中HA基因的S203T、PA基因的R269K及D547E变异与重症病例的相关性具有统计学意义（P〈0．05）。HA基因变异主要分布在ca与cb抗原决定簇上，NA基因上无耐药突变，膜蛋白（M2）基因均发生耐药性突变，其余毒力相关基因未见突变。结论2009年北京市甲型HlNl流感病毒与疫苗株A／California／07／2009（H1N1）同源性较高，发现与重症及死亡病例相关的突变位点，未发现毒力基因突变。

摘要：目的建立一种检测新型冠状病毒的巢式PCR方法,作为实时荧光PCR法检测新型冠状病毒的补充,并探讨该方法在临床样本检测中的初步应用价值。方法根据新型冠状病毒基因保守序列,利用在线软件设计N、S基因引物,构建巢式PCR反应体系,N基因巢式PCR及产物测序用于定性检测,S基因PCR产物测序用于型别初步鉴定。检测梯度稀释新型冠状病毒阳性样本评价检测灵敏度,检测流感病毒和人冠状病毒OC43、229E、HKU1、NL63等样本评价其特异性。分别检测Ct值>33与Ct值<33的各15份新型冠状病毒阳性样本,对扩增产物进行测序及比对分析,对检测方法进行验证。结果所建立的巢式PCR法可扩增出355 bp N基因片段及449 bp S基因片段的特异性条带,冠状病毒229E、OC43、HKU1、NL63、H3N2亚型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒阳性样本无扩增条带。N基因片段最低检测限可达Ct值37.21。30份新冠核酸阳性样本中,巢式PCR检测的N基因阳性符合一致率达100%(30/30);S基因阳性符合一致率达60%(18/30)。28份样本N基因片段测序成功,BLAST与新型冠状病毒相似性100%。12份样本S基因片段可获得位点突变特征结果。结论建立了可特异检测新型冠状病毒的巢式PCR方法,并可通过对PCR扩增产物测序分析其位点突变特征,可作为实时荧光PCR法的补充。

摘要：目的采用环介导等温扩增(LAMP)技术建立针对人肺炎衣原体基因的特异、灵敏、快速、可视的检测方法。方法对Gen Bank登录的肺炎衣原体的Omp1基因序列进行生物学分析,利用Primer Explorer V4软件,针对保守区域设计LAMP引物,建立并优化反应条件,对其特异性、灵敏度和稳定性进行评估。结果该方法能特异性扩增出肺炎衣原体,而对流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒、人博卡病毒均无特异反应,其最低检测限度为50copies/μL。另外,反应周期可在50 min内完成,并通过反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化判读。结论本研究建立的针对人肺炎衣原体的LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、简便快速、可视化判读结果、成本低等优势,为基层或现场进行肺炎衣原体的快速确诊提供了可靠的技术支撑。

摘要：目的采用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立了一种针对甲型流感病毒的特异、灵敏、快速、可视、简便的检测方法。方法根据甲型流感病毒M基因的保守序列,利用PrimerExplorer V4软件,设计了一套针对M基因的8个区域的5条特异性引物,优化了反应体系与扩增条件,并验证其特异性与灵敏性。结果该方法能检测出H1、H3、H5、H6、H7、H9亚型流感病毒,而对乙型流感病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人冠状病毒、人偏肺病毒、人腺病毒、人博卡病毒均无扩增反应,其最低检测限度为50拷贝/μl。另外,扩增反应只需要40min就能判读结果,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化诊断。结论本研究建立的RT-LAMP检测方法具有高特异性、灵敏度、快速简便、可视化判读结果等优势,适合在基层进行甲型流感病毒的快速检测,并可以应用于大流感疫情的准确筛查。