摘要：目的　针对SARS冠状病毒 (SARS CoV)M、N、S和E蛋白 ,构建 4种重组真核表达质粒pVAX1 M、pVAX1 N、pVAX1 S和pVAX1 E ,为研制SARSDNA疫苗奠定基础。方法　根据GenBank中SARS病毒基因序列分别设计M、N、S和E引物 ,用RT PCR方法从感染SARS病毒的Vero E6细胞中扩增得到M、N、S和E片段 ,构建重组质粒pVAX1 M、pVAX1 N、pVAX1 S和pVAX1 E。并以重组质粒转染COS 7细胞 ,用免疫细胞化学和Westernblot方法鉴定重组质粒体外的表达。结果　经酶切鉴定及DNA序列测定证实重组质粒构建正确 ,细胞转染实验表明 ,构建的 4种重组质粒均能在COS 7细胞内表达。结论　成功构建 4种SARS CoV 4种蛋白抗原真核表达质粒 ,并能在真核细胞内获得表达。

摘要：目的:构建真核表达质粒PVAX1/M,免疫Balb/c小鼠,测定其诱导的特异性免疫应答,探讨传染性非典型肺炎(severeacuteresperatorysyn-drome,SARS)防治和康复的可能手段。方法:根据GenBank中登录的SARS-CoVM蛋白基因序列设计引物,采用反转录聚合酶链反应方法从感染SARS病毒的VeroE6细胞中扩增得到约666bp的片段,构建重组真核表达质粒PVAX1/M。体外转染COS-7细胞,细胞免疫化学方法鉴定目的蛋白的表达后,肌肉注射免疫Balb/c小鼠(雌性,6周龄),加强免疫3次后,测定其诱导免疫应答的能力。结果:构建的重组质粒经酶切及测序鉴定,与GenBank中登录的序列完全一致;细胞免疫化学方法均显示重组质粒可在COS-7细胞中表达有免疫原性的SARS-CoVM蛋白;免疫小鼠血清中检测到较高滴度的抗体,并能诱导特异性的CTL反应。结论:成功构建真核表达质粒PVAX1/SARS-CoVM,并能诱导小鼠产生特异性的免疫应答,为SARS的预防康复提供了可能的治疗手段。

摘要：以冷适应、温度敏感、减毒的B/Ann Arbor/1/66流感病毒株作为重配病毒骨架,对其6个内部基因片段进行了全基因合成,同时人工引入9个氨基酸突变.构建了8个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒,命名为:pAB121-PB1,pAB122-PB2,pAB123-PA,pAB124-HA,pAB125-NP,pAB126-NA,pAB127-M和pAB128-NS.在成功拯救冷适应A型流感病毒的基础上,利用反向遗传学技术成功获救了具有感染性的重配B型流感病毒株,命名为rMDV-B.该重配病毒株以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架,其中HA和NA来源于2006～2007年当年流行株B/Malaysia/2506/***-B在鸡胚尿囊液和MDCK细胞中的HA效价可达1∶64～1∶512.实验结果暗示:从单一供体病毒株可以产生有效的减毒活B型流感病毒疫苗候选株,能够为将来人用流感疫苗的设计提供可借鉴的模型.

摘要：目的　构建针对SARS CoV的特异性siRNA质粒 ,利用RNA干扰技术抑制该病毒复制与感染。方法　根据SARS CoV的全长基因序列 ,以 4个不同的部位为靶点 ,分别设计、合成含有 19nt干扰序列的一段寡核苷酸 ,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSilencer 3 .1 H1载体中 ,构建表达siRNA的质粒。采用脂质体法将质粒转染VeroE6细胞 ,经潮霉素抗性筛选后 ,再对稳定表达的细胞进行细胞病变、病毒空斑形成和MTT实验 ,以观察干扰效应。结果　对所构建的质粒分别测序 ,确定其含有siRNA的序列与预期的特异性干扰序列一致。用不同浓度的SARS CoV感染转染质粒后的细胞 ,与阴性对照相比 ,其细胞病变减轻、活细胞显著增加 ,病毒空斑明显减少。结论　利用RNA干扰能有效的抑制SARS CoV在细胞中的复制 ,并对细胞有保护作用 ,为预防、治疗SARS提供了新的思路和方法。