摘要：目的　通过对不同扩增条件的优化 ,建立两种马脑炎病毒的快速RT -PCR检测方法。方法　根据东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒基因组相应序列设计引物 ,然后采用两步法及两种一步法分别对其基因组序列进行RT -PCR扩增 ,并用琼脂糖凝胶电泳进行观察。结果与结论　三种方法均可从两种马脑炎病毒感染的乳鼠脑和细胞上清中扩增出单一的DNA片段 ,其大小与预期的相一致。与其他两种方法相比 ,本研究所建立的一步法更为简便快速、价格低廉 ,为进一步组装这些病毒的检测试剂盒奠定了基础。

摘要：为了制备灵敏的可检测多种烈性病毒性病原体的基因芯片,本研究设计了针对21种烈性病毒性病原体的基因芯片检测探针,每种5条,长50 bp.并以甲病毒属的基孔肯亚病毒和黄病毒属的黄热病毒细胞培养物为检测模型,摸索了合适的病毒基因处理与扩增方法.将提取的病毒RNA先用DNaseⅠ处理,以去除掉其中的DNA分子,然后利用病毒属特异性引物进行反转录,以引导病毒基因组的合成,从而尽可能地减少宿主细胞基因成分的干扰.进行随机PCR扩增后将扩增产物与基因芯片进行杂交,分别出现了4条基孔肯亚病毒探针信号和5条黄热病毒的探针信号,说明所设计的检测探针具有较好的特异性,可用于这2种病毒的特异性检测.这种病毒基因样品的处理和扩增方法也为此基因芯片的临床应用奠定了基础.

摘要：为鉴定我国森林脑炎病毒亚型,了解基因组结构与生物功能的关系,同时为森林脑炎病毒新型疫苗研制打下基础,对森林脑炎病毒森张株编码区序列进行测定。根据已发表的sofjin-HO、Oshima5-10株序列设计9对重叠引物,通过RT-PCR扩增不同的cDNA片段,分别克隆至pGEM-T载体,转化DH5α菌,挑阳性克隆PCR、酶切鉴定后测序。结果表明森张株编码区全长10 245nt,编码3414个氨基酸。我国森林脑炎病毒森张株与Oshima5-10、sofjin-HO、sofjin同源性最近,属于远东亚型。

摘要：基因芯片技术具有高通量、高度平行性、高度自动化的特点。在对传染病病原体的研究中,基因芯片技术已应用于耐药性相关遗传多态性分析、基因分型、生物种系的遗传进化分析、宿主与病原体相互关系分析、病原体检测等。但在病原体检测方面,与检测细菌相比,基因芯片技术对病毒的高通量检测难度较大。简要介绍了目前基因芯片技术在病毒性病原体检测中的研究进展、所采用探针的类型及设计原则、基因芯片杂交结果的影响因素等。

摘要：森林脑炎（ＴＢＥ）病毒是黄病毒科中的成员，象其它的黄病毒一样，基因组ＲＮＡ含有单个开放阅读框架，在基因组的５′端编码病毒的结构蛋白，在３′端编码非结构蛋白，翻译成聚蛋白后，通过细胞和病毒编码的蛋白酶裂解产生单个的病毒蛋白，成熟的病毒是由两个相关的Ｅ和Ｍ膜蛋白脂质包膜所包围的立体对称的核衣壳组成。包膜Ｅ蛋白在病毒的感染周期中对细胞的识别和穿入细胞具有极其重要的功能，同时Ｅ蛋白诱导保护性的免疫反应，Ｅ蛋白内某一位点单个氨基酸的改变可引起病毒毒力的改变。因此，对ＴＢＥ病毒分子生物学的研究有助于了解病毒与宿主细胞相互作用的机理，为病毒感染的异性诊断、疫苗的研制和抗病毒药物的设计提供理论依据。

摘要：目的 :构建我国SARS病毒BJ0 1株基因组全序列的亚cDNA克隆 ,为进一步构建该毒株的全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法 :根据BJ0 1株病毒基因组序列中含有的特异酶切位点 ,利用DNAstar软件设计 7对引物 ,然后通过RT PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的 7个cDNA片段 ,并分别将其克隆至pGEM TEasy或Topo载体。结果与结论 :已构建出SARS CoVBJ0 1株基因组的 7个亚cDNA克隆 ,经酶切鉴定和序列测定表明 ,所获得的cDNA克隆为BJ0 1株病毒的特异序列。

摘要：目的建立能对虫媒病毒进行属水平筛查及种水平鉴定的基因芯片技术,为虫媒病毒提供一种高通量的检测与鉴定技术。方法从GenBank获得13种虫媒病毒的全部基因组序列,利用Clustal X和BLAST等比对软件,设计针对这些虫媒病毒所在的3个属的通用寡核苷酸探针,用于病毒的属水平筛查。然后设计针对每种病毒的特异性寡核苷酸探针,用于每种病毒的检测鉴定。寡核苷酸探针长度均为70mer,将设计好的探针与GenBank上所有病毒基因组序列进行比对,验证其种属特异性,然后进行探针合成和基因芯片制备。所有病毒在BSL-3和BSL-2实验室进行培养,待检病毒核酸通过锚定随机PCR进行扩增,经荧光染料标记后与基因芯片杂交,利用激光共聚焦扫描仪扫描后进行结果分析。结果所检测的13种虫媒病毒均可获得种特异性及所在属的属特异性杂交信号,非特异性杂交信号不明显。分别用两种不同的病毒混合后,进行模拟混合病毒感染,也得到了相应的特异杂交信号。结论初步建立了13种虫媒病毒的基因芯片检测技术,可用于这些病毒的属水平筛查及种水平鉴定,并且可以进行混合感染标本的检测,为虫媒病毒的检测与鉴定提供了一种新的手段。

摘要：目的建立快速检测TBEV的实时定量TaqMan PCR方法。方法根据GenBank发表的TBEV全基因组序列资料，在其C基因和NS5基因区段设计TBEV的特异探针和引物，在E基因区段设计普通PCR引物。以MDJ01株作为待检毒株，黄病毒属的另外7株病毒用来评价检测体系的特异性。测定病毒的TCID50值并制备病毒拷贝数标准品，分别用于制作病毒滴度和拷贝数标准曲线。与常规PCR方法进行了灵敏度比较，并建立了病毒感染小鼠的检测模型。结果该检测方法的灵敏度可达到100拷贝／反应或0．1TCID50，是常规PCR方法的十倍。作为对照的黄热病毒疫苗株17D、登革1～4型病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒Chin-01株结果均为阴性，证明该体系具有良好的特异性。经过多批次、不同浓度样品的重复检测，批内和批间变异系数均小于5％，表明该体系具有较好的稳定性和重复性。结论建立了一种灵敏、特异、简便易行的TBEV的TaqMan实时定量PCR检测方法，为TBEV的预防控制和诊断提供了一种技术手段。

摘要：为了建立能对25种重要人兽共患病病毒进行筛查及鉴定用的基因芯片技术,本实验首先设计针对每种病毒的寡核苷酸探针并进行探针特异性的生物信息学验证.然后探索病毒核酸随机扩增方法,优化杂交动力学条件,建立本芯片标准的数据处理分析方法.最后用细胞培养的病毒和模拟临床标本验证芯片的敏感性与特异性.结果表明,锚定随机PCR扩增法适合于本芯片病毒核酸的扩增;芯片杂交前用0.25%NaBH4进行封闭,最优杂交条件为51℃,2h及50%甲酰胺浓度;芯片具有较好的敏感性及检测特异性.初步结果表明,本实验所建立的基因芯片技术可应用于对25种重要人兽共患病病毒进行筛查及鉴定.

摘要：目的建立同时检测1-4型登革病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒和黄热病病毒等5种虫媒病毒的悬浮芯片检测方法。方法根据GenBank发表的上述病毒的序列,通过生物信息学分析和参考相关文献,在黄病毒属高度保守的NS5区设计属通用引物和种特异检测探针。将探针共价交联到不同的Luminex色标微球上,利用属通用引物进行RT-PCR扩增,与混合微球杂交,最后利用Luminex200仪器分析荧光强度值。结果将平均荧光强度的判定阈值定为背景对照的两倍可以对这5种共8型病毒进行有效鉴定。通过多批次的实验,均能准确鉴定出上述5种病毒,没有出现交叉反应,且批次间的平均荧光值偏离不大,变异系数（CV）均小于8%,表明本方法的特异性和稳定性均较好。在空斑滴定病毒的基础上,对本方法的检测敏感性进行了验证,结果表明对乙脑和黄热病病毒的检测敏感性可达到1.4个PFU,对西尼罗病毒可达14个PFU。进而将本方法用于检测55份临床标本和传代标本,其检测结果和种特异RT-PCR方法相比,具有很高的一致性,而且其在混合样本的快速检测中具有显著的优势。结论通过设计合适的引物和探针,成功建立了可同时检测和分型5种虫媒病毒的悬浮芯片方法,为疾病的诊断和预防以及流行病学调查提供了新的手段。