摘要：【目的】trag(transfer gene G)是利用IVIAT(in vivo induced antigen technology)通量筛选鉴定的猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)感染相关因子,研究该基因在猪链球菌(Streptococcus suis,SS)中的分布情况,研究康复血清与免疫血清在免疫印迹中的反应性有无,间接证明其在体内感染与体外培养时表达差异。【方法】鉴于我国分离株trag与GenBank公布的SS2北美株89/1591的trag序列有95.8%的同源性,据此设计和合成一对检测引物,对SS2我国江苏及四川流行株、其他临床分离株和参考株及SS1、SS1/2、SS9、SS7及C群猪源链球菌共43株进行PCR扩增。另设计一对引物,扩增5株SS代表菌株trag的完整阅读框,并对扩增产物进行测序。据软件分析后,选择TRAG(Transfer protein G)免疫原性良好的区域片段的核酸设计表达引物,PCR扩增后定向克隆至表达载体pET28a(+)构建表达质粒,表达蛋白转印到PVDF膜上,分别与SS2猪康复血清和猪高免血清反应。【结果】trag在SS2中94%(30/32)阳性,SS9中67%(4/6)阳性,SS7阳性,SS1、SS1/2及C群菌阴性。5株细菌TRAG的氨基酸序列与SS2中国株98HAH33、05ZYH33及北美株89/1591同源性>97%。所获得重组蛋白只能被康复血清识别。【结论】从SS致病株中检出感染相关基因trag,提示该基因可能与SS致病性有关,重组蛋白的免疫转印结果表明,TRAG可能与SS2体内感染相关。

摘要：针对猪胸膜肺炎放线杆菌种特异性基因ApxⅣ和血清1、3、5、7型的特异Cps基因设计5对引物,通过扩增条件的优化,建立了猪胸膜肺炎放线杆菌及血清1、3、5、7型的五重PCR检测方法。特异性试验显示,对血清1~15型参考菌株均扩增出相应的预期目的条带,对6种引起猪发病的主要病原菌均未扩增出任何条带。敏感性试验表明,对各血清型细菌纯培物的敏感性皆为103 CFU/mL;对1、5型感染样品的敏感性为104 CFU/g,对3、7型感染样品的敏感性为103 CFU/g。可在4.5 h左右直接从病猪肺脏中得到检测结果。方法的建立为相关临床病例快速诊断及流行病学调查提供了有效的技术支持。

摘要：为建立检测PHoV的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据PHoV的V P2基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有V P2基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法的检测灵敏度为10拷贝;而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3.29%,表明该方法的重复性较好。对华东地区采集的225份临床样品进行检测,结果显示,PHoV的阳性率为14.2%。本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可以为PH oV的流行病学调查和发病机制等研究提供可靠的工具。

摘要：为定量检测猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,建立了检测PEDV的TaqMan荧光定量PCR方法.根据PEDV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果表明,该试验建立的荧光定量PCR方法在1μl 10^1 ～ 10^9拷贝之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90％与100％之间.该方法的检测灵敏度为10拷贝,与常规RT-PCR方法相比,该方法敏感性更高,而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应,批内和批间的变异系数均低于3％,表明该方法的重复性较好.对华东地区采集的130份临床样品进行检测,结果显示,PEDV的阳性率为63.1％.