摘要：本研究旨在探讨融合蛋白TAT-RIG-I-GFP原核表达载体的构建并验证TAT在跨膜递送中的作用。首先设计了4对特异性引物,克隆了绿头鸭Anas platyrhynchos RIG-I基因,构建了pET-TAT-RIG-I-GFP和pET-RIG-I-GFP原核表达载体;转化至感受态DE3细胞,经IPTG诱导表达,利用His60镍亲和层析柱纯化,进行SDS-PAGE;然后,将纯化后的上述两种表达蛋白分别孵育DF-1细胞;最后利用荧光显微镜观察是否在DF-1细胞产生相应的荧光。结果证实,携带有TAT的pET-TAT-RIG-I-GFP融合蛋白在DF-1细胞中显示出明显的绿色荧光;而不具有TAT的pET-RIG-I-GFP蛋白却不能显示绿色荧光。这表明携带TAT的融合蛋白已成功进入DF-1细胞,并在跨膜递送过程中发挥了关键作用。上述为进一步研制家禽的抗病毒药物奠定了基础。

摘要：参照GenBank发表的序列,在金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌16S rRNA与23S rRNA之间的区域设计了3对引物,参照念珠菌和隐球菌的18S rRNA的序列设计1对引物,建立了检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法。参照Skladny的方法制备模拟了细菌感染临床标本。结果表明:本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性,多重PCR方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度为104CFU/mL,检测无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为102CFU/mL、103CFU/mL和103CFU/mL。通过对采自临床型乳腺炎(46个)和隐性乳腺炎(167个)动物共计213个乳样分别用传统细菌学培养法和多重PCR方法进行检测,多重PCR对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率(P0.05)。

摘要：参照国外已发表的M41高可变区S1序列设计一对引物 ,跨度为 1 .7kb左右。采用差速离心法浓缩病毒 ,提取病毒RNA ,经RT_PCR扩增 ,得到与设计同样大小的PCRDNA片段 ,将PCR产物纯化 ,与质粒载体 (pGEM_TEasyVector)连接 ,并转入大肠杆菌JM1 0 9,获取阳性克隆。增菌培养后用小量碱提取法提取质粒 ,利用PCR扩增法与EcoRI酶切分析进行鉴定。对阳性质粒DNA进行测序 ,利用Omiga2 .0、Dnasis等分子生物学软件进行分析 ,并与标准M41株、T株等进行序列比较 ,结果表明 :山东传支A株与标准M41株同源性较高 ,最大同源率为 99% ;与标准T株同源性较差 ,最大同源率为 80 %。理论酶切图谱与M41相同 ,为同一基因型。

摘要：参照澳大利亚鸡传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ）００２７３ 毒株基因组序列设计的 １ 对引物，位于 Ｖ Ｐ２ 高可变区两端，通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ，扩增了 ５ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 山东分离株 Ｖ Ｐ２ 基因的 ６０７～１ ０８０ 位核苷酸片段（ａａ２０３～３０６）。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物经纯化后，分别用 Ｄｒａ Ⅰ、 Ｓａｃ Ⅰ、 Ｓｓｐ Ⅰ、 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｓａｕ３ Ａ Ｉ共 ５ 种限制性内切酶（ Ｒ Ｅ）进行消化处理，结果 ５ 个分离株均为 Ｄｒａ Ⅰ（－ ）、 Ｓａｃ Ⅰ（－ ）和 Ｓａｕ ３ Ａ Ｉ（＋ ）， Ｌ Ｃ２ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（＋ ）， Ｌ Ｃ１ 和 Ｊ Ｎ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（－ ）， Ｌ Ｃ１ 和 Ｌ Ｃ２ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（＋ ）， Ｊ Ｎ、 Ｌ Ｌ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（－ ）；５ 个分离株的酶切图谱与美国变异株迥异，而 Ｔ Ａ 株与日本超强毒株 ９０１１ 相类似。５ 个分离株与现用疫苗株对比，至少在 Ｖ Ｐ２ 可变区内存在着一定的差异，这可能是 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 接种免疫鸡群仍然暴发 Ｉ Ｂ Ｄ 的原因之一。

摘要：将鹅副粘病毒QY分离株蚀斑纯化后,根据已发表的鹅副粘病毒SF02株全基因序列,分别设计合成3对引物,设计合成F基因引物,经RT-PCR方法扩增,克隆入PMD18-T载体,鉴定、测序。测序后拼接得出F基因的全序列长度为1 662 kb,编码553个氨基酸残基,与GenBank下载的几株参考毒株比较F基因编码区的核苷酸序列,发现所测QY株F基因核苷酸序列同源性与参考毒株SF02为98.3%,与LaSota分别为82.4%,同源性分析表明分离株QY与国内的强毒株参考毒株的同源性较高。

摘要：分离并鉴定出山东省不同地区的 IBV分离株 A、B、C、D和北京分离株 F,利用中和试验分别对各分离株及标准株M4 1 、T等进行血清分型。设计一对引物 ,分别对各毒株的 S1 基因进行 RT- PCR扩增 ,扩增片段长约 170 0 bp,利用其 PCR产物进行 Hae 酶切 ,根据酶切图谱 ,进行基因分型。结果表明 :A、C、D和 M4 1 酶切图谱相同 ,属 Mass基因型 ,分别为 90 0、4 0 0和30 0 bp左右的片段 ;北京 F株有 4条酶切条带 ,与 4 /91基因型不同 ,分别为 10 0 0、30 0、2 0 0和小于 10 0 bp左右的片段 ;B株有4条酶切条带 ,理论推断与 T株相似 ,分别为 70 0、5 0 0、30 0和 180 bp左右的片段 ,可能为同一基因型。血清学分型结果与基因分型结果不符。

摘要：参照Genbank中传染性支气管炎病毒 (IBC)M41纤突蛋白S1的基因序列 ,设计一对引物 ,对山东地区IBV分离株RNA进行反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR) ,成功扩增出约 16 34bpS1基因片段。将扩增出的S1基因分别克隆到TEasy质粒载体中 ,获得重组质粒 ,提取质粒DNA ,利用Eco .RI酶切证实了重组质粒的特异性 ,并进行序列测序。克隆出的序列已被GeneBank收录 ,序列号为 :AY0 4 3313。将得到的序列与标准株M41进行核酸序列和氨基酸同源性比较分析 ,与M41的核苷酸同源率99 %。利用Omigo 2 .0软件对克隆出的山东IBV进行了理论酶切位点分析 ,在BstYI、AluI和BgⅢ位点与M41不同。结合血清学和分子生物学实验结果推测

摘要：从以产蛋下降为主的樱桃谷种鸭以及出现神经症状的雏鸭各分离出1株病毒,分别命名为BZ株和LC株。该2株病毒对SPF鸡胚和健康鸭胚均能产生相同的病变,分离病毒不能凝集鸡、鸭、鹅、鸽等的红细胞,在鸭胚成纤维细胞(DEF)能够产生典型的细胞病变(CPE),电镜下观察到约50nm的病毒粒子。病理组织学研究表明,二者在临床上均可导致脑组织危害,表现为脑膜水肿、血管充血和皮质层神经胶质细胞增生等。血清学检测表明,分离病毒与禽流感病毒(AIV)、鸭瘟病毒(DEV)、新城疫病毒(NDV)等病原无交叉。生物学特性鉴定该病原为有囊膜单股RNA病毒。利用不同禽病的特异性引物分别进行PCR或RT-PCR,均未扩增出特异条带。设计随机引物进行RT-PCR,扩增出基因片段,利用GenBank进行Blast同源比较,结果发现,分离病毒与以色列火鸡脑膜脑炎病毒(Israel turkey meningo-encephalitis virus,TMEV)和在马来西亚发现的Tembumu病毒至少在2段基因上具有较高的同源性,属于黄病毒属。测序表明,分离病毒与Tembumu病毒的非结构蛋白(NS5基因)和囊膜蛋白(E基因)的核苷酸同源性为86.7%～90.2%和87.0%～91.8%,与TMEV的NS5基因和E基因的同源性为72.4%～73.2%和72.7%～72.8%。2分离株之间E基因和NS5基因的核苷酸同源性均为99.5%。血清中和试验表明,BZ株阳性血清可以中和LC病毒,因此证实二者可能是同一种病毒。综合以上研究,建议将该病命名为"鸭病毒性脑炎"(Duck viral encephalitis disease)。

摘要：为建立适合犬布鲁氏菌病临床检测的单重PCR方法,通过对比粗糙型(犬种)与光滑型(羊种、牛种和猪种)布鲁氏菌基因组DNA的序列差异,设计1对引物并优化反应条件,建立了可初步鉴别犬4种布鲁氏菌的PCR方法,然后对该方法的特异性和灵敏度进行评价,并对20份犬布鲁氏菌血清学阳性的血液样品进行临床检测。结果显示,利用建立的PCR反应体系对牛种、羊种和猪种布鲁氏菌均能扩增出717 bp的目的条带,对犬种布鲁氏菌能扩增出366 bp的目的条带;最低可检测到犬种、羊种、猪种和牛种布鲁氏菌基因组DNA浓度分别为5.07×10^(-2)、6.20×10^(-2)、7.80×10^(-3)和5.50×10^(-2) ng/μL;20份血液样品中共检测到3份犬种布鲁氏菌阳性样品,与使用GB/T 18646—2018引物的PCR检测结果一致。结果表明,本试验建立的单重PCR方法简捷、特异、敏感,适合基层兽医实验室对犬布鲁氏菌病的检测与鉴定。

摘要：传染性喉气管炎(ILT)是家禽重要的呼吸道疾病,主要危害成年鸡和产蛋鸡。但是,自2019年4月以来,在山东省多个地区发生多起商品肉鸡、地方品种肉鸡等感染该病并致病现象。临床主要表现为严重的呼吸困难、喘鸣、打喷嚏和伸颈呼吸,严重的咳出带血的分泌物,呼吸道粘膜出血和充血。经绒毛尿囊膜接种10日龄SPF鸡胚,5 d后可产生典型的绒毛尿囊膜病变。参考GenBank中传染性喉气管炎病毒(ILTV)的序列,设计出一对针对其ICP4基因的特异性引物,对可疑病料和分离出的病原分别进行PCR扩增,结果扩增出目的条带,经测序证实为ILTV。特异性和敏感性试验证实,新建立的PCR可快速、准确地鉴定出病原,具有一定的临床推广应用价值,为有效防控ILT的发生奠定了基础。