摘要：目的:包涵体在变复性前通常需要用洗涤液多次重复洗涤以除去杂质,这种洗涤方式往往造成包涵体收率低或洗涤时间长或纯度不高,直接影响到重组蛋白产品最终的产量和质量。通过对sTNFR1包涵体的洗涤条件进行优化,以期指导该品种的工业化生产。方法:首先采用由脱氧胆酸钠和尿素组成的两因素五水平的析因设计,以洗涤后目的蛋白的含量为评价指标,进行方差分析,选出最优组合;通过对方差结果的分析提出不同于重复洗涤的分步洗涤方式,选出较优的分步洗涤方式;然后放大洗涤样品量,验证重复洗涤和分步洗涤的结果;另外,针对不同发酵批次和产量的样品,进一步验证比较重复洗涤和分步洗涤的效果。结果:重复洗涤的方差结果表明单独使用脱氧胆酸钠或尿素洗涤的产量优于两者的联合使用,但其纯度低于两者的联合使用,其中1mol/L尿素洗涤3次(W3组合)获得的目的产量最高;分步洗涤中2%脱氧胆酸钠洗涤第一次,2%脱氧胆酸钠+2mol/L尿素洗涤第二次的洗涤方式(FW6组合)既能有效提高目的蛋白纯度,又节约了时间,是较优的组合方式;同一发酵水平(约20%目的产量)不同规模样品(3g和50g)分别经过W3和FW6洗涤后,蛋白纯度提高到约26%和31%,且后者的目的收率高于前者,表明分步洗涤优于重复洗涤;针对不同发酵水平的样品(约10%和60%目的产量),分步洗涤的效果也优于重复洗涤,但对于低发酵水平的样品,分步洗涤对其纯度的提高更明显。结论:通过对该包涵体洗涤条件的摸索,找到一种较重复洗涤更有效的分步洗涤方法,既提高了目的纯度又节约了洗涤时间,为包涵体的洗涤提供了一种新的思路。

摘要：目的通过实验设计(Design of Experiment,DoE)方法对重组的可溶性人肿瘤坏死因子αⅠ型受体(soluble tumor necrosis factorαreceptorⅠ,sTNFαRⅠ)包涵体复性工艺中的关键参数进行优化。方法采用DoE软件中的中心复合设计(Central Composite Design)建立二次模型(Quadratic Model),对复性工艺中游离巯基浓度(C_(-SH))和复性液蛋白浓度(C-Pro)2个关键参数进行优化。设置2个响应值:每克湿菌体中所获得的sTNFαRⅠ蛋白收率和每制备10 g sTNFαRⅠ蛋白所需复性体积(V-10 g),通过DoE软件对模型数据进行评估分析。在sTNFαRⅠ收率最高及V_(-10g)最小的前提下,采用二次模型响应面分析预测最优的复性参数值,并通过两次放大试验对优化结果进行验证。结果由2因素5水平2个Block共14组试验结果所建立的DoE响应面二次模型中心点重复性好,试验点均符合正态分布。响应面二次回归分析中,分别以sTNFαRⅠ收率和V_(-10g)作为响应值进行失拟检验的P均>0.05,模型失拟不显著。预测值和真实值接近,模型拟合度好。信噪比均>4,表明该模型有效,可用于复性工艺优化指导。通过以上模型得出:当C_(-Pro)为0.48 mg/m L,复性起始C_(-SH)为8.69 mmol/L时模型愿望值(0.643)最高,sTNFαRⅠ收率为16.38 mg/g,V_(-10g)为36.73 L。通过两次放大试验对优化结果进行验证,sTNFαRⅠ收率分别为11.34和9.72 mg/g,与优化前(收率均值5.1 mg/g)相比,有所提高。结论 DoE软件中心复合设计的二次模型可用于sTNFαRⅠ包涵体复性条件的筛选,且筛选结果为后续工艺放大提供了可靠的实验依据。

摘要：目的 采用DoE设计方法对人可溶性肿瘤坏死因子I型受体（soluble tumour necrosis factorαreceptors I,sTNFα-R玉）的聚乙二醇（PEG）修饰工艺参数进行优化,以期获得稳定、可控的工艺参数。方法 采用UNICORN（DoE）软件中Central Composite Face Centered（CCF）模型对sTNFα-R玉的3个PEG修饰工艺参数,即溶液pH值（pH）、反应时间（Time）和PEG与蛋白质量比（PEGrate）进行优化,设置4个响应值（多PEG修饰蛋白峰面积、单PEG修饰蛋白峰面积、未修饰蛋白峰面积及单PEG修饰蛋白峰面积与多PEG修饰蛋白峰面积比值）揭示其化学反应过程,确定参数操作空间;应用蒙特-卡罗模拟法（Monte-Carlo Simulation）对优化参数进行风险评估。结果3因子17组试验结果的重复性较好,中心点重复组响应值介于最低值和最高值之间,且随机分布,符合DoE试验设计的要求;4个响应值所对应的回归系数（R2）均〉0.75,预测准确性（Q2）〉0.5,模型有效性（Model Validity）〉0.25,重复性（Reproducibility）〉0.5,模型预测与实验值之间偏差较小,具有可靠的预测准确性;17组试验结果标准残差在允许范围（-4～4）之间,线性较好,预测值与观测值之间相关性较好,建立的模型拟合度高,可较为准确地预测试验结果。溶液pH值对多PEG修饰产量影响较小,随着Time和PEGrate的升高,多PEG修饰产物增加,单PEG修饰产物经二次或多次修饰形成多PEG修饰产物,减少Time和PEG用量可减少多PEG修饰产物;单PEG修饰产物随着pH上升,产量有所增加,与Time呈二次项关系,在***交互作用中,减少PEG用量可增加单PEG修饰产物量;减少Time和降低PEG用量可提高单PEG修饰产物与多PEG修饰产物的比值,有利于下游纯化。确定了工艺参数的操作空间,当pH为5.5时,反应时间控制在30 h以上,PEG与蛋白质量比控制在3.7以下,符合预设值;pH在6.5时,反应时间控制在22～35 h之间,PEG与蛋白质量比控制在2.5～4.0之间,符合预设值;蒙特-卡罗模拟法对在最佳操作参数（反应时间34.1 h,溶液pH值6.5,PEG与蛋白质量比2.5）时模型预测的响应值（单PEG修饰产物峰面积值5 635.82和单PEG修饰产物与多PEG修饰产物比值3.226 5）的风险评估,10万次模拟试验可信度分别为99.825%和99.982%,试验风险较小,工艺可控。结论 确定了sTNFα-R玉蛋白PEG修饰稳健的工艺参数。

摘要：目的：通过优化PET11b-s TNFαRI 5＇mRNA翻译起始区（TIR）二级结构从而提高可溶性肿瘤坏死因子I型受体（sTNFαRI）在大肠杆菌[*** BL21（DE3）]中的表达水平。方法：通过对PET11b-s TNFαRI mRNA 5＇端TIR区二级结构的自由能及核苷酸位置熵分析,设计相应的引物对mRNA 5＇翻译起始区（TIR）相应密码子进行突变,从而使核糖体结合位点（RBS）及起始密码子（AUG）暴露于发夹结构之外,此外将p ET11b核糖体结合位点由GAAGGAGA突变为GAAGAA,以利于翻译复合体的组装以及翻译起始。通过基因克隆的方法将5＇端TIR区优化后的序列与s TNFαRI序列一起克隆到p ET11b载体中,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,阳性转化子经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测。结果：通过对PET11b-s TNFαRI 5＇TIR mRNA二级结构优化,经SDS-PAGE和Western blot分析表明重组s TNFαRI的表达水平较优化前提高50%~60%。结论：通过对重组载体翻译起始区（TIR）mRNA序列的二级结构优化可以有效提高目的蛋白的表达水平,对进一步工业化生产具有重要的应用价值。