摘要：背景:研究证明缺血/再灌注损伤可诱导心肌细胞凋亡,再灌注后线粒体膜电位的丧失是细胞凋亡发生的必然途径。如果能保护线粒体膜电位则可能减少细胞凋亡。目的:观察纳洛酮对乳鼠心室肌细胞缺氧/复氧后线粒体膜电位及细胞凋亡的影响,研究其对缺氧心肌细胞的保护效应。设计:观察对比实验。单位:解放军总医院心内科。材料:心肌细胞凋亡检测实验于2004-12在解放军总医院病理生理实验室完成。选用新生乳鼠10只;心肌细胞腺粒体膜电位检测实验于2006-03在同一实验室完成,选用新生乳鼠20只。实验动物均由解放军总医院动物中心提供。盐酸纳洛酮注射液(0.4g/L),北京四环药厂产品,批号0206272;最低必需培养液(Dulbecco,DEME),Gibco公司;平衡盐溶液(PBS)、小牛血清,SIGMA公司。方法:将当日生乳鼠,局部碘酒酒精消毒后胸骨正中开胸,取心尖前1/3心室肌进行细胞培养。培养4d后选择细胞生长情况良好的培养瓶(细胞数>106/瓶)分为3组:对照组(正常培养)、缺氧组(缺氧/复氧)、纳洛酮组(缺氧/复氧加纳洛酮干预)。其中,对照组3瓶细胞,缺氧组和纳洛酮组各15瓶细胞。缺氧组和纳洛酮组又根据缺氧、复氧时间不同分为3个时间点:缺氧2h/复氧0h;缺氧2h/复氧2h;缺氧2h/复氧4h,每个时间点5瓶细胞。缺氧组:换预先充过体积分数0.95N2+体积分数0.05的CO2气体的体积分数0.01小牛血清DEME培养液,培养瓶内也用体积分数0.95N2+体积分数0.05的CO2气体充入置换其中的空气,密封后37℃孵育;达规定时间后换正常条件下(体积分数0.95空气+体积分数0.05的CO2)孵育。纳洛酮组:缺氧/复氧处理同上,同时加入盐酸纳洛酮,使培养液中药物终浓度达5μmol/L(加药容积≤总培养液的0.5%)。对照组不进行缺氧/复氧及用药处理,滴等量生理盐水,作为各组的缺氧0h/复氧0h时间点。干预后,以荧光染色-流式细胞仪检测缺氧/复氧后不同时间心肌细胞的线粒体膜电位变化及凋亡情况。主要观察指标:①缺氧组与纳洛酮组各时间点线粒体膜电位变化情况;②各组在缺氧2h/复氧4h细胞存活、凋亡、坏死水平比较。结果:①缺氧后,缺氧组、纳络酮组细胞的线粒体膜电位均下降。各时间点纳络酮组细胞线粒体膜电位均高于缺氧组(P<0.01)。线粒体膜电位的大幅度下降不是发生在细胞缺氧期,而是复氧期。②缺氧2h/复氧4h,缺氧组细胞的凋亡、坏死比率分别为(9.88±0.98)%和(5.10±0.29)%,明显高于纳络酮组[(2.41±0.52)%和(3.56±0.56)%,P<0.01]。缺氧组内细胞凋亡发生率明显高于坏死发生率(P<0.05)。结论:早期应用纳洛酮可明显减轻和延缓心室肌细胞缺氧/复氧后线粒体膜电位的下降并减少细胞凋亡和坏死的发生。

摘要：背景:目前对脂肪间充质干细胞在临床应用前还有许多问题需要解决,如脂肪间充质干细胞是否可以分化为完全意义上的心肌细胞,是否具备心肌细胞所特有的功能。如何提高脂肪间充质干细胞向心肌细胞的分化率,如何提高在移植后的归巢和存活率等问题的解决对于指导干细胞的临床应用有重要的意义。目的:观察体外培养并诱导成人脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞。设计:随机对照观察。单位:解放军总医院心内科实验室。材料:脂肪取自解放军总医院普外科腹部手术患者(均知情同意);IMDM(Hyclon公司),Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),5-aza(Sigma),抗心肌特异性肌钙蛋白T(TnT)多克隆抗体(福建迈新生物技术公司),抗CD44、抗CD45、抗CD34、HLA2DR、Ⅷ因子单克隆抗体、抗结蛋白(Desmin),抗α-横纹肌肌动蛋白、抗肌球蛋白重链购自北京中杉金桥生物技术有限公司,DAB染色剂由北京中杉金桥生物技术有限公司提供,RT-PCR试剂盒由Invitrogen公司提供,心房利钠肽放免试剂盒(中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所)。方法:实验于2005-03/2006-04在解放军总医院心内科实验室完成。细胞培养:采用消化法和贴壁培养法分离培养脂肪间充质干细胞。干预及检测:对第3代细胞进行细胞表面分子CD44,CD13,CD105,CD45,CD34,HLA-DR,factorⅧ的免疫细胞化学鉴定,并用5-氮杂胞苷(5-aza)进行诱导,于诱导后第7,14,21,28天采用RT-PCR法检测心肌化基因GATA4和Nkx2.5的表达,应用放射免疫法测定心房利钠肽含量。主要观察指标:①细胞表面标志鉴定结果。②心肌化基因GATA4和Nkx2.5的表达。③心房利钠肽含量。结果:①细胞表面标志鉴定:原代细胞CD13、CD44、CD105阳性表达,CD45、CD34、HLA2DR、Ⅷ因子阴性表达。诱导后7d,所有细胞Desmin,α-横纹肌肌动蛋白、抗肌球蛋白重链和抗心肌特异性肌钙蛋白T呈阴性反应,大多数细胞CD44阳性表达。诱导后14d少量细胞出现Desmin、α-横纹肌肌动蛋白和抗肌球蛋白重链抗原阳性表达,TnT阴性表达,部分细胞CD44呈阳性表达。诱导后21d,多数细胞Desmin、α-横纹肌肌动蛋白、抗肌球蛋白重链和抗心肌特异性肌钙蛋白T呈阳性反应,CD44呈阴性表达。②心肌化基因GATA4和Nkx2.5的表达:诱导后14d出现GATA4和Nkx2.5cDNA的表达。③心房利钠肽含量:诱导后14d心房利钠肽含量为(0.022±0.01)ng/L,与诱导后7d比较差异无显著性(P>0.05),诱导后21d和诱导后28d分别为(7.92±0.21)和(8.12±0.50)ng/L,与诱导后7d比较差异均有显著性(P0.05)。结论:成人脂肪组织中含有间充质干细胞,且可在5-氮杂胞苷诱导21d后分化为心肌样细胞。

摘要：背景:脂肪间充质干细胞具有多向分化能力,并且相对更加容易获得,因此作为一种新的细胞工程的种子细胞日渐受到重视。目的:观察从大鼠皮下分离脂肪间充质干细胞的体外培养情况,并对其进行免疫细胞化学染色等鉴定。设计:动物实验。单位:解放军总医院心内科。材料:选用1只健康雄性Wistar大鼠,清洁级,鼠龄4个月,体质量200g;Ⅰ型胶原酶、DMEM培养基、特级胎牛血清(GIBCO公司);免抗大鼠CD13、CD34、CD44、105、Ⅷ因子、HLA-DR、VWF、Myosin等多克隆抗体及SABC试剂盒(武汉博士德公司);绿色荧光蛋白-重组腺病毒包装载体为北京本元正阳基因技术有限公司产品。方法:实验于2006-10在解放军总医院心内科完成。①细胞分离和培养:全麻下取Wistar大鼠腹股沟脂肪垫0.3g,剪碎,消化后培养,镜下观察有大量梭形贴壁细胞后二三天换DMEM培养液,观察细胞生长情况。调整细胞浓度为2×107L-1,接种于96孔细胞培养板,每孔100μL。从第2天起每日随机取3孔,胰蛋白酶消化细胞,分别用血球计数板在倒置显微镜下计数。②细胞存活率的计算:收集第3至第8代细胞,加入预配好的DMSO冻存液,2～4周后复苏,台盼蓝染色检测细胞存活率。③免疫细胞化学染色及鉴定:以2×107L-1的细胞数接种多孔培养板,24h后行CD13、CD34、CD44、CD45、CD105、Ⅷ、HLA-DR、VWF因子等细胞表面抗体的免疫细胞化学(SABC法)鉴定及油红染色。④多细胞系定向诱导分化及鉴定:用多孔板接种后加含特定诱导因子的培养基进行多系定向诱导分化,并进行油红O脂肪颗粒染色,对成骨诱导组进行碱性磷酸酶组化染色,对成心肌诱导组进行肌浆球蛋白免疫组化染色。⑤转染腺病毒携带的绿色荧光蛋白基:用96孔板接种第4代ADMSC,同时加入Ⅰ型腺病毒为载体的绿色荧光蛋白,以不同MOI值1∶50、1∶100、1∶150、1∶200转染,观察转染情况。主要观察指标:①细胞分离和培养观察结果。②冻存与复苏后细胞存活率。③免疫细胞化学染色及鉴定结果。④多细胞系定向诱导分化及鉴定结果。⑤转染腺病毒携带的绿色荧光蛋白结果。结果:①从0.3g皮下脂肪分离出约3.6×105贴壁细胞,并可在体外多代传代培养扩增。②细胞冻存2～4周后复苏用台盼蓝染色示存活率在90%以上。③各代CD13、CD44、CD105等免疫细胞化学染色均阳性,CD45、Ⅷ因子、HLA-DR、VWF等免疫细胞化学染色均阴性。④从第2代开始,各代均可见少量细胞油红O染色阳性,而且在延长培养基的换液时间后,油红O染色阳性细胞明显增多。体外多系定向诱导分化后油红O染色、碱性磷酸酶染色、肌浆球蛋白免疫组化检测分别阳性。⑤转染72h后荧光显微下观察,在MOI值1∶200见绝大多数细胞发出绿色荧光,转染成功,粗测转染率在90%以上。结论:可以从大鼠皮下脂肪成功分离出大量具有成脂、成骨、成肌等多向分化潜能的间充质干细胞,该细胞可以在体外培养进行多代传代及大量扩增、长期冷冻保存,并且成功转染了Ⅰ型腺病毒为载体的绿色荧光蛋白基因。

摘要：目的：观察腹蛇咬伤后咬伤部位早期持续封闭负压引流（VSD）结合三棱针打孔法治疗的效果.方法：根据患者中毒时间、病情严重程度采用配伍设计,选取2012年7-8月份我院接诊手部腹蛇咬伤肿胀患者40例,随机分为A组（切开引流组,10例,在咬伤部位行＂＋＂字形切开至皮下层）、B组（切开引流＋VSD组,10例,伤口＂＋＂字形切开,然后行持续VSD）、C组（单纯三棱针打孔组,10例,在咬伤伤口周围用三棱针多点打孔20～30个）和D组（三棱针打孔＋VSD组,10例,在咬伤伤口周围用三棱针多点打孔20～30个,然后行持续VSD）.入院后同时给予抗腹蛇毒血清、抗感染及中医中药等治疗.观察患者患肢肿胀消退时间、伤口部位感染、脓肿、坏死发生率及住院时间.结果：①各组间患肢肿胀消退时间差异显著,D组明显低于A、B、C组[（2.1±1.5）d比（5.0±2.7）d,（3.4±1.7）d,（3.1±3.0）d;P〈0.05];②B、D组无一例出现伤口部位感染、脓肿形成及坏死,与A、C组（20%和40%）比较差异显著（P〈0.05）.③各组间伤口愈合时间及住院时间差异显著,D组均明显低于A、B、C组[（3.5±1.5）d比（7.5±2.5）d,（5.3±1.3）d,（4.7±1.3）d; P〈0.05].结论：腹蛇咬伤后咬伤部位早期三棱针打孔法结合持续VSD可显著缩短患者患肢肿胀消退时间及住院时间.

摘要：目的:观察腹蛇咬伤后咬伤部位早期三棱针打孔法排毒的治疗效果。方法:根据患者中毒时间、病情严重程度采用配伍设计,选取2011-07我部接诊腹蛇咬伤手患者30例,按病情严重程度分级后再分别分入三棱针打孔组、切开排毒组和对照组。入院后同时给予抗腹蛇毒血清、抗感染及中医中药等治疗。观察终点:患者患肢肿胀消褪时间、伤口部位感染、脓肿形成及坏死等情况、其它严重并发症如心肌酶升高、血小板减少及住院时间。结果:①三棱针打孔组、切开排毒组患肢肿胀消退时间明显小于对照组(P<0.05),但前两组间无差异。②三棱针打孔组皮肤感染、脓肿形成及坏死明显低于其他两组。③其他并发症各组间无显著差异。④三棱针打孔组住院时间明显短于切开排毒组和对照组(均P<0.05)。结论:腹蛇咬伤后咬伤部位早期三棱针打孔法排毒疗法可显著缩短患者患肢肿胀消褪及住院时间,并显著减轻伤口局部感染、脓肿及坏死情况的发生;与传统的伤口切开排毒法相比有明显的优势。