摘要：RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默已成为基因功能分析的高效工具,设计出高效的siRNA是RNA干扰(RNAi)成功的关键,但现有的siRNA设计规则存在许多不一致性,使得高效siRNA设计困难重重。为了对这些设计规则进行进一步的验证并探讨不同设计规则在高效siRNA设计中的价值,研究设计了9条靶向zfy基因(zfy-1、zfy-2、zfy-3、zfy-4、zfy-5、zfy-6、zfy-7、zfy-8、zfy-9)和4条靶向zfx基因(zfx-1、zfx-2、zfx-3、zfx-4)的siRNA并构建了重组载体,转染28~32日龄仔猪睾丸组织分离的猪生精细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测zfy和zfx基因mRNA的表达。结果表明:每个siRNA对靶基因的下调水平不同,zfy-9的沉默效率最高,为89%,zfy-1、zfy-2、zfy-3、zfx-1对靶基因的表达没有沉默作用。通过对13个siRNA序列特征进行分析表明,在siRNA设计中符合越多的碱基偏好性准则,沉默效率越好;但是不同的准则重要性不同,siRNA反义链中第10位的U和第13位的A/U对高效siRNA设计更有作用,应优先考虑;靶位点的选择对高效siRNA的设计也有重要作用。

摘要：为了探究Zfy基因在性别控制中的作用,试验运用RNAi技术,设计并合成了2对靶向猪Zfy基因的shRNA序列,构建了重组质粒(shRNA-a,shRNA-b),将其转染到体外培养的猪生精细胞中,荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测生精细胞中Zfy基因mRNA的表达,然后选取4头健康公猪进行体内干扰试验,分为A组和B组,每组2头,将重组质粒注射到猪睾丸中,A组注射shRNA-a,B组注射shRNA-b,对照组为试验猪场不进行注射的公猪,观察子一代性别比例。结果显示,qRT-PCR检测shRNA-a和shRNA-b对生精细胞中Zfy基因的抑制效率分别为33%(P0.05)。本试验成功构建干扰猪Zfy基因的重组质粒,并应用于动物试验,证实Zfy基因可以影响后代的性别比例,在动物性别控制中发挥一定的作用,但导致体内干扰试验结果与预期结果相反的原因仍需进一步验证。

摘要：为了研究Zfx基因在精子发生过程中的作用,本研究利用RNA干扰技术针对猪Zfx基因m RNA设计3条si RNA并构建sh RNA干扰载体(p LL3.7/e、p LL3.7/f、p LL3.7/g)。对体外培养生精细胞进行干扰后,通过q RT-PCR测定Zfx基因m RNA表达丰度筛选出有效的干扰片段。然后利用有效的干扰载体进行睾丸注射,开展体内干扰试验。结果表明:构建的3个干扰载体,其中p LL3.7/e、p LL3.7/f对生精细胞Zfx基因的干扰率分别为44%(P0.05);用p LL3.7/e、p LL3.7/f进行体内试验,结果显示后代仔猪雄性率率分别为51%(P>0.05),59%(P<0.05)。结论:Zfx基因干扰可以影响猪后代的性别比例,本研究可为今后进一步研究动物性别控制提供依据。