摘要：目的分析微卫星5联简单重复序列在分枝杆菌基因组中的分布情况，并评价其简单序列重复区间（ISSR）分型能力，为分枝杆菌的基因分型及流行病学研究提供新的研究工具。方法实验菌株为17株分枝杆菌菌株和41株MTB临床分离株，17株分枝杆菌菌株包括分枝杆菌标准株15株、MTB临床菌株1株和MTB无毒株（H37Ra）1株。利用MICdb2．0软件分析微卫星数据库收录的分枝杆菌基因组中5联简单重复序列（CAGCG）n的分布特征，并以该序列为基础设计ISSR引物（5’-CAGCGCAGCGCAGCG-3’），用于分枝杆菌种间和种内菌株的基因分型分析。结果生物信息学分析显示（CAGCG）n在数据库收录的大部分分枝杆菌基因组中均有较高含量，其中在H37Rv、CDCl551、牛分枝杆菌和鸟分枝杆菌基因组中出现的次数分别为40、39、39和33次，且主要分布在编码序列区（分别为39、36、38和30次）。ISSR引物对分枝杆菌菌种的基因分型分析显示，15种常见菌种聚为2大簇，第1簇含有2个亚型，第2簇含有4个亚型，种间表现出高度的遗传多样性；ISSR引物对MTB临床菌株的分析结果显示，41株菌株聚为2簇，各簇分别有2个亚型，提示该引物对种内菌株也表现出良好的分辨力。结论以（CAGCG）n建立的ISSR分型体系，可用于分枝杆菌种间和种内菌株的遗传多样性分析。

摘要：目的构建分枝杆菌简单序列重复区间（inter-simple sequence repeat，ISSR）分型系统，为结核分枝杆菌的基因分型、菌种鉴定以及流行病学的研究提供新的研究工具和研究思路。方法根据结核分枝杆菌基因组中简单重复序列（SSR）的丰度和频率，设计用于分枝杆菌基因分型的ISSR引物，以分枝杆菌属的DNA为材料，分析DNA浓度、Mg^2＋浓度、dNTP浓度、Taq酶的含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响，构建分枝杆菌的ISSR分型体系，并通过该体系筛选获得扩增结果稳定、多态性强的引物。结果经过优化实验建立了分枝杆菌ISSR-PCR最佳反应体系，20μl的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为：10ng模板DNA，1U Taq酶，0．5μmol／L引物，1．5mmol／L MgCl2，0．2mmol／L dNTPs。利用该反应体系从10个ISSR引物中，筛选出了3个稳定性高、重复性好的引物，对分枝杆菌属28个菌种的标准菌株及52株结核分枝杆菌临床分离株进行了ISSR遗传多样性分析。结果显示，28个分枝杆菌菌种，除了结核和牛分枝杆菌之间具有较高的相似性，两两之间存在着高度的遗传多样性；52株结核分枝杆菌菌株在用ISSR进行分型时，大部分菌株表现出了较高的遗传相似性。结论建立了分枝杆菌属的ISSR分型体系。

摘要：目的利用焦磷酸测序技术,建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增 rpoB 基因片段,经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板,设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测 rpoB 基因耐药突变区的81 bp 序列突变情况,与 H_(37)Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌 rpoB 基因突变检测平台,32株利福平耐药株均在 rpoB 基因片段上检测到突变,22株利福平敏感株未检测到突变,检测结果与直接测序符合率达100%。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平 rpoB 基因突变。

摘要：目的寻找新的鉴别诊断MTB复合群（MTC）高特异度和敏感的核酸靶标。方法利用简单序列重复区间（ISSR）分型技术平台筛选MTC的特征片段，克隆测序获得特征序列并进行序列同源性分析，以该序列为基础设计MTC特征引物，并对211株分枝杆菌菌株（其中MTC107株、非结核分枝杆菌104株）进行鉴别检测。利用分枝杆菌属特征序列16s rRNA和MTC特征序列IS6110的鉴别结果，对MTC特征引物检测结果进行评估。结果通过ISSR分型获得588bp的MTC特征片段，该序列为MTC菌株的特征序列，位于MTB标准株H37Rv基因组的315947-316534位，以该序列为基础设计MTC鉴别引物MTCF／R，16srRNA基因在211株分枝杆菌菌株中的扩增结果均为阳性，IS6110序列在107株MTC菌株中扩增阳性率为99％（106／107），在104株NTM菌株中阴性检出率为100％（104／104），MTCF／R引物在MTC菌株中的扩增阳性率为100％（107／107），在非结核分枝杆菌菌株中的阴性检出率为100％（104／104）。结论通过ISSR分型技术筛选出的MTC特征序列可作为新的核酸扩增靶标用于MTC和非结核分枝杆菌的鉴别诊断。