摘要：环腺苷酸(cAMP)和环鸟苷酸(cGMP)对于细胞的许多功能有重要作用。磷酸二酯酶(PDEs)催化cAMP和cGMP水解开环分别生成AMP和GMP,这是细胞内降解cAMP和cGMP的唯一途径。PDEs可分为11个家族,其中有8个家族可以水解cAMP,包括能专一性地水解cAMP的PDE家族(如PDE4),和既可水解cAMP又可水解cGMP的PDE家族。PDE4同工酶主要存于在炎症细胞中。PDE4可分为A、B、C、D 4个亚家族,根据其N端的特殊结构,有长、短和超短三种形式。PDE4催化区三维结构的阐明有助于它们功能的研究和相关药物的设计。PDE4通过与其它蛋白如抑制蛋白、A激-酶锚定蛋白(AKAP)以及活化的C激酶1受体(RACK1)等相互作用使cAMP浓度区域化,选择性地调节各种细胞功能。PDE4作为一个治疗靶点,研究其选择性抑制剂具有重要的意义,可以用于治疗由炎症引起的疾病,如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、阿尔采末病(AD)、帕金森病(PD)和中风等由潜在的炎症引起神经元受损造成的中枢神经系统疾病。

摘要：以5月和6月两个不同时段采集的分别产于青海省化隆县和四川省康定县的冬虫夏草(Cordycepssinensis)新鲜子实体为材料,采用分子生物学方法,以rDNA-ITS序列为分子标记,对蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)与冬虫夏草之间的关系进行了探讨。以真菌通用引物ITS1/ITS4分别对蝙蝠蛾拟青霉及冬虫夏草子座和僵虫基因组DNA进行PCR扩增,获得的片段克隆到pMD18-TVector上进行测序,结果表明,随机挑取的46个克隆与某些已在GenBank中注册的中国被毛孢(Hirsutella sinensis)或冬虫夏草的rDNA-ITS序列的一致性均在99%以上,但与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列的一致性约为72%。根据蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列设计了两对特异引物,分别以不同产地及不同生长时期共4个批次的冬虫夏草子座和僵虫基因组DNA为模板,进行PCR及巢式PCR扩增,均得到了相应片段,该片段与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列具有100%的一致性。在GenBank中注册号为AB067740的另一个标明为冬虫夏草的rDNA-ITS序列与注册号为AJ309353的中国被毛孢的rDNA-ITS序列一致性仅为87.3%,但根据AB067740序列设计特异引物,也从冬虫夏草基因组DNA中扩增到其相应序列。研究结果表明,在天然冬虫夏草中除了中国被毛孢之外,还普遍存在着蝙蝠蛾拟青霉等内寄生菌。

摘要：天然药物合成生物学技术是一种采用多基因控制的方式,实现天然产物代谢途径在异源底盘细胞中的重构。启动子是调控基因表达的一种顺式元件,对多基因控制的代谢途径的平衡起着重要的作用。为了筛选获得性能优越的启动子用于多基因控制的代谢途径,一个基于红色荧光蛋白的酵母检测质粒被构建。首先,根据已经发表的红色荧光蛋白基因,设计并合成了一系列引物,通过连续重叠PCR的方法合成了全长红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer,并将该红色荧光蛋白基因导入酿酒酵母,SDS-PAGE、Western blot以及荧光显微镜观察都表明该红色荧光蛋白基因在酿酒酵母中获得了表达。然后,将具备功能的DsRed-Monomer基因与酿酒酵母表达载体pGBT9进行重组,获得能进行启动子文库筛选的启动子检测质粒pGBT9Red。为了检测该质粒的效能,通过PCR从酿酒酵母基因组中克隆得到了6种启动子(包括4种诱导型启动子和2种组成型启动子),并将6种启动子分别克隆到pGBT9Red中,置于红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer上游,通过荧光成像确定启动子对红色荧光蛋白基因表达的调控效率。结果表明,6种启动子(GAL1、GAL2、GAL7、GAL10、TEF2和PGK1)在酿酒酵母中均能调控DsRed-Monomer的表达。该检测质粒的成功构建为进一步进行启动子活性分析和启动子元件文库筛选奠定基础。

摘要：目的构建虎眼万年青EST文库,筛选相关基因并对其进行功能鉴定。方法 CTAB法提取虎眼万年青鳞茎总RNA,通过SMART方法构建全长cDNA文库,获得库容大于3×106cfu/ml的均一化全长cDNA文库。随机挑取1440个单克隆测序,并对得到的EST序列进行Blast分析(NR、NT、Swiss-Prot和KEGG)以及COG功能分类。结果获得1398条有效EST序列,含有1146条单一基因,cDNA文库平均插入片段长度在1.5kb以上,全长率54%,冗余率3.3%。其中两段基因都与Syntaxin43基因相似,同源性分别为76%和89%,根据Blast比对结果,推断这两个基因片段是同一个Syntaxin基因的5'端和3'端。据此设计引物,以虎眼万年青cDNA为模板,通过常规的RT-PCR扩增得到全长Syntaxin基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体,接着导入大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot证实该基因在大肠杆菌获得表达。结论首次构建成功虎眼万年青EST文库;并从中筛选得到一条和Syntaxin具有同源性的基因,实现了Syntaxin蛋白在大肠杆菌中的表达,为Syntaxin基因功能的鉴定奠定基础。