摘要：研究旨在探究差异代谢物泛酸(PA)对鸡胚胎干细胞(ESCs)向原始生殖细胞(PGCs)分化过程中的作用,为从代谢角度解析PGCs形成机制提供新的理论基础。试验基于转录组学筛选出PA,通过CCK8与EdU试验探究PA及其代谢抑制剂PZ的适宜添加浓度;最后,分别通过观察细胞形态、qRT-PCR检测PGCs特异标记基因、间接免疫荧光和流式细胞分析等分析PA代谢在ESCs向PGCs分化过程中的作用。结果显示:参与PA代谢相关的基因在ESCs与PGCs中呈现差异性表达,且富集于生殖细胞分化相关的通路(Pantothenate and CoA biosynthesis、TGF-beta signaling pathway和AMPK signaling pathway);PA和PZ的适宜添加浓度分别为20μmol/L和80 nmol/L;PA组在第6天的类胚体数目显著低于PZ组,PA组中CVH和C-KIT3的表达量显著低于PZ组(P<0.01);PA组的DDX4阳性细胞数显著低于PZ组(P<0.01)。结果表明添加PA抑制PGCs的形成,添加PZ促进PGCs的形成。

摘要：研究旨在构建TBX6的过表达和干扰载体,为后续研究TXB6在精原干细胞(Sper⁃matogonial stem cells,SSCs)形成过程中的功能奠定基础。通过qRT-PCR检测TBX6在胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和SSCs的表达水平,根据NCBI上提供的TBX6 CDS区的序列,设计引物扩增目的片段,将其连接到经线性化的慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copG⁃FP-T2A-Puro上,构建TBX6的过表达载体;同时,根据TBX6 CDS区设计三个干扰靶点,在退火后将其连接到经线性化的干扰载体pLVX-shRNA2-puro上,并且进一步将三个干扰载体转染鸡成纤维细胞系(DF-1),观察荧光表达情况并通过qRT-PCR检测其干扰效率。结果显示,TBX6在SSCs上的表达量显著高于ESCs(P<0.05),测序和双酶切验证显示成功构建TBX6过表达及干扰载体;干扰载体转染DF-1细胞后均能稳定表达EGFP荧光蛋白,且shRNA2-TBX6的干扰效果最好。结果表明,TBX6过表达及干扰载体构建成功,且经定量检测后确定shRNA2-TBX6的干扰效果最好。

摘要：研究旨在探究miR-1458与TBX6的靶向调控关系。试验基于前期建立视黄酸(Retinoic acid,RA)体外诱导胚胎干细胞(ESCs)向精原干细胞(SSCs)的分化模型,通过RNA-seq测序结果发现ESCs向SSCs分化过程中差异表达的miR-1458,采用miRNA定量检测miR-1458在ESCs/SSCs中的表达量,miR-1458靶基因富集通路分析筛选出富集通路,分析其与生殖细胞发育的相关性。基于前期联合分析RA诱导ESCs的mRNA-seq数据中|log2(fold change)|>8筛选出的与miR-1458互作的差异性mRNA,依据靶基因预测软件数据库在线预测该基因与miR-1458是否存在结合位点,利用qRT-PCR验证两者的关系,同时利用同源重组法将靶基因的3′UTR及点突变序列插入pMIR-REPORT^(TM)双荧光素酶报告载体中,共转染DF-1细胞,通过双荧光素酶报告载体确定miR-1458与TBX6的靶向调控关系。结果显示:ESCs向SSCs分化过程中差异表达miR-1458,miR-1458在生殖细胞分化过程中发挥重要作用;miR-1458与TBX63′UTR存在结合位点;miR-1458和TBX6分别在ESCs和SSCs中呈现此消彼长的表达趋势;miR-1458能够抑制TBX6的表达;miR-1458可靶向TBX63′UTR区调节TBX6的表达。研究表明miR-1458在鸡的ESCs和SSCs中呈现差异性高表达,并且miR-1458能够直接靶向调控TBX63′UTR区从而调节TBX6的表达,为后续研究miR-1458在SSCs形成过程中的机制探究奠定基础。

摘要：试验旨在探究精原干细胞(SSCs)形成过程中的关键miR-302d行使功能的分子机制。试验克隆mi R-302d前体序列并连入PGMLV-CMV-MCS-EF1-Zs Green1-T2A-Puro构建mi R-302d过表达载体(mi R-302d mimics);合成mi R-302d的干扰靶点并连入PGMLV-SC5载体构建mi R-302d干扰载体(mi R-302d inhibitor)。通过生物信息预测获得mi R-302d靶基因并构建其3′UTR的野生型(WT)和突变型载体(MT);将mi R-302d过表达载体分别与WT和MT载体共转染DF-1和293T细胞,检测靶基因3′UTR的活性。同时检测在DF-1细胞中过表达或干扰mi R-302d后靶基因的表达变化。结果显示:成功构建mi R-302d的过表达和干扰载体;预测结果显示Tle4为mi R-302d的潜在靶基因,且该基因为ESCs分化为SSCs过程的重要基因;双荧光素酶活性检测结果显示不论是在DF-1还是293T细胞中,与转染WT+mi R-NC组相比,转染WT+mi R-302d组的双荧光素酶活性显著下降(P0.05),且过表达mi R-302d后下调Tle4的表达,而干扰mi R-302d后上调Tle4的表达。结果表明,miR-302d可直接调节靶基因Tle4的表达。

摘要：本文旨在探究差异代谢物泛酸(PA)和脂肪酸氧化(FAO)在鸡胚胎干细胞(ESCs)向原始生殖细胞(PGCs)分化过程中的作用,为从代谢角度解析PGCs形成机制提供新的理论基础。采用BMP4诱导体系,基于课题组前期对泛酸及其抑制剂(PZ)和脂肪酸氧化激活剂(BMS)/抑制剂(Per)的最适添加浓度,设置5个分组:Control组、PA+BMS组、PA+Per组、PZ+BMS组、PZ+Per组。通过观察细胞形态、qRT-PCR检测PGCs特异标记基因、间接免疫荧光和流式细胞分选等探究泛酸代谢及其下游的脂肪酸氧化在ESCs向PGCs分化过程中的作用。细胞形态观察结果显示,诱导至第6天,PZ+BMS组的类胚体数目显著升高(P<0.01),PA+Per组显著减少(P<0.05);qRT-PCR结果显示,CVH和C-KIT在PZ+BMS诱导组中的表达量极显著升高(P<0.01),而在PA+Per组中的表达量则显著降低(P<0.01);间接免疫荧光和流式细胞分选结果显示,PZ+BMS组DDX4阳性细胞率显著高于对照组(P<0.05),而PA+Per组DDX4阳性细胞率极显著低于对照组(P<0.01)。以上结果表明,抑制泛酸代谢并激活脂肪酸代谢能够促进PGCs的形成,该研究为利用代谢物完善PGCs的体外诱导培养体系提供新见解。