摘要：目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的人血管内皮细胞生长因子121的真核质粒,检测所制备的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞在不同时长缺氧后血管内皮细胞生长因子的水平。方法:设计携带酶切位点的扩增引物,通过PCR技术扩增人血管内皮细胞生长因子121编码基因全序列,以粘端连接克隆法将其编码片段定向连接入质粒载体pEGFP-N2的多克隆位点中,构建pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒,采用酶切法、PCR以及DNA序列测定法鉴定所构建的重组质粒。全骨髓差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增传代,通过形态学观察及表面标记物进行细胞鉴定。通过阳离子脂质体介导pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染体外培养的骨髓间充质干细胞,使用荧光显微镜检测hVEGF121/EGFP融合蛋白的表达。将制备好的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞在体外缺氧环境下分别培养6,12,24h,另设相同缺氧干预下的空白骨髓间充质干细胞组,以转染空载pEGFP-N2质粒的骨髓间充质干细胞组作为对照,采用RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达量。结果:酶切鉴定法、PCR鉴定法、DNA序列测定皆证实pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒构建成功。使用pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染骨髓间充质干细胞后,荧光显微镜检测提示hVEGF121/EGFP蛋白在骨髓间充质干细胞中存在表达。在体外模拟心肌缺氧的环境下分别培养6,12,24h后,RT-PCR检测示转染重组质粒的骨髓间充质干细胞组各时间段缺氧后的血管内皮生长因子mRNA表达量均高于对照组(P0.05);空白骨髓间充质干细胞的血管内皮生长因子mRNA表达量随缺氧时程的延长而增加。结论:①成功构建携带人VEGF121/EGFP融合蛋白表达基因的真核表达质粒,并在骨髓间充质干细胞中获得表达。②证实表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞能在24h以内的不同时长缺氧下,维持较空白骨髓间充质干细胞更强、更稳定的血管内皮生长因子表达。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞在植入心肌缺血/梗死区域后,面临缺氧缺血微环境,其如何通过旁分泌细胞因子来发挥重建侧支微循环、修复心肌的作用,是目前存在争论的焦点之一。目的:探讨骨髓间充质干细胞在不同时程缺氧环境下血管内皮生长因子的表达规律。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/11在南昌大学第二附属医院分子医学实验中心完成。材料:清洁级新西兰大白兔2只,由南昌大学医学院实验动物中心提供。方法:常规差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞。细胞缺氧微环境在Anaero Pack密闭方盒中产生,盒中置入一次性缺氧催化袋GENbox anaer(可吸收O2,产生CO2),指示条监测氧的耗竭,根据缺氧培养时程分为缺氧0,6,12,24h组。主要观察指标:RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达,Western Blot法检测血管内皮生长因子蛋白的表达。结果:血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达水平均为缺氧0h组<6h组<12h组<24h组(P<0.01)。结论:缺氧24h以内的培养环境下,骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子的水平呈缺氧时程依赖性增加。

摘要：背景:已有实验证实,人热休克蛋白22(Heat shock protein22,HSP22)存在于人的多种组织中,但构建其真核表达质粒是否可转染人血管内皮细胞并完整表达。目的:构建pEGFP-N1/HSP22真核表达质粒并观察在内皮细胞中的表达。设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-03/10在南昌大学第二附属医院分子中心完成。材料:pEGFP-N1真核表达质粒及DH5α为南昌大学第二附属医院分子中心保存,MCF-7细胞来源于南昌大学生化实验室馈赠,人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)株购至南京基凯生物技术公司。方法:采用反转录聚合酶链式反应从人MCF-7细胞中扩增热休克蛋白22基因,将热休克蛋白22基因连接到真核表达载体pEGFP-N1中,并转化DH5α,获得阳性克隆进行双酶切和测序鉴定。用脂质体法将重组质粒转染人脐静脉血管内皮细胞。主要观察指标:荧光显微镜、反转录-聚合酶链反应法及Western blot检测热休克蛋白22在人脐静脉内皮细胞中的表达。结果:①琼脂糖凝胶电泳检测聚合酶链反应扩增产物,热休克蛋白22基因片段长约613bp,与预期分子量相符,测序结果证实克隆完全正确;其阳性克隆进行酶切鉴定与热休克蛋白22理论值相符。②反转录-聚合酶链反应法检测转染的人脐静脉血管内皮细胞中有热休克蛋白22mRNA表达;Western blot检测可见一特异性热休克蛋白22蛋白条带存在。结论:成功构建了携带人热休克蛋白22及pEGFP-N1真核表达质粒,并验证已在人脐静脉血管内皮细胞中表达。

摘要：背景:冠脉动脉造影被称为诊断冠心病的"金标准",但由于投照体位的不当,造成病变血管段人为"缩短"及冠状动脉显影影像质量较差等均可引起误诊或漏诊。目的:探讨不同体型、心型患者的冠状动脉主干及各分支的最佳投照体位的特异性关系。设计:对照观察。单位:南昌大学第二附属医院心内科。对象:2001-11/2006在南昌大学第二附属医院行行冠状动脉造影术患者1369例。所有受试者均签署了冠状动脉造影书面知情同意书,实验方案得到了南昌大学医学院医学伦理委员会的批准。方法:将1369例患者分为3组:①肥胖组:体质量指数26～31kg/m2,489例,横位心。②普通体型组:体质量指数23～25kg/m2,502例,普通心型。③消瘦组:体质量指数17～22kg/m2,378例,垂位心型。对3组受试者的左冠状动脉主干,前降支近段,前降支中远段、回旋支近段、回旋支中远段、右冠状动脉近中段,远段等血管的Compart分析结果进行归纳。主要观察指标:最佳造影角度。结果:1369例均进入结果分析。①冠状动脉主干最佳造影角度:左前斜位(45±5)°/足位(25±5)°或右前斜位25°/足位35°,肥胖者其角度大10°左右,消瘦者小10°左右(P均﹤0.05)。②前降支近段最佳造影角度:右前斜位(50±8)°/头位(23±8)°,肥胖者其角度大10°左右,消瘦者其角度小10°左右(P均﹤0.05)。③前降支中远段最佳造影角度:右前斜位(40±5)°/头位(45±5)°或左前斜位(11±5)°/头位(45±5)°。④回旋支近段最佳造影角度:左前斜位(45±5)°/足位(35±5)°或AP/足位36°。⑤回旋支中远端最佳造影角度:左前斜位(45±5)°/足位(35±5)°或右前斜位(6±4)°+足位(33±5)°。⑥右冠状动脉近中段最佳造影角度:左前斜位(35±5)°/足位(14±5)°或左前斜位(48±5)°/头位(15±5)°,肥胖、消瘦组左前斜位角度都要大15°左右,右前斜位胖者角度小10°左右,瘦者角度大10°左右(P<0.05)。⑦右冠状动脉远段最造影角度:左前斜位(53±5)°/足位(17±5)°。结论:通过这些体位的投照多能清楚了解整个冠脉的情况,最佳造影角度下的血管狭窄百分比测量能显著提高其定量分析的精度。

摘要：目的：探讨内质网应激在Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用.方法：在体外原代培养出生1～3 d大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定.设计并化学合成3对靶向bim的siRNA,用脂质体法将siRNA转染心肌细胞,筛选沉默效率最高的siRNA.实验分组：（1）空白对照组;（2）缺氧组;（3）缺氧＋脂质体组;（4）缺氧＋阴性对照siRNA组;（5）缺氧＋Bim-siRNA组.MTT法观察细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞内钙离子浓度变化情况;Western blotting检测内质网应激标志分子caspase-12和三磷酸肌醇（IP3）的表达情况.结果：免疫组化鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功.在荧光显微镜下,转染了阴性对照siRNA组的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;Western blotting 结果显示,Bim-siRNA转染均能有效降低Bim蛋白的表达,其中第2对沉默效率最高,达到86.73%.缺氧损伤导致心肌细胞活性明显下降（P〈0.05）,转染Bim-siRNA后细胞活性较阴性对照组升高.缺氧细胞凋亡率较对照组明显增加（P〈0.01）,细胞内钙离子浓度明显增高,而沉默bim的表达能降低细胞凋亡率和细胞内钙离子浓度.缺氧导致内质网应激标志分子caspase-12和IP3表达较空白对照组明显上调（均P〈0.05）,而抑制Bim表达后caspase-12和IP3表达明显降低.结论：沉默bim的表达能有效抑制缺氧导致心肌细胞凋亡的作用,内质网应激标志分子caspase-12和IP3可能参与了Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡的过程.这有望为临床心肌缺血缺氧损伤的治疗提供新思路.

摘要：高血压病最主要的临床特点是全身动脉血压升高，并伴有脉压差的变化。在高血压的病理状态下动脉内皮细胞、血管平滑肌细胞、肾小球毛细血管内皮细胞及肾系膜细胞所承受的机械力都发生了变化，从而使这些细胞的形态、功能都发生变化进而使靶器官（心、脑、肾）功能改变。为了研究机械化力学对细胞功能的影响，我们在原有的工作基础上设计了一套高压培养细胞装置，模拟细胞在高血压病理状态下所承受的机械力学的变化。

摘要：目的:探讨唯BH3域蛋白Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death)在缺氧所致大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法:在体外原代培养出生1～3 d的大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。设计并化学合成3对靶向bim的siRNA,用脂质体法将siRNA转染心肌细胞,筛选沉默效率最高的siRNA。实验分组:(1)正常对照组;(2)缺氧组;(3)缺氧+脂质体组;(4)缺氧+阴性对照siRNA组;(5)缺氧+bim-siRNA组。倒置显微镜下观察心肌细胞的搏动频率和节律。全自动生化分析术检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,用MTT法测定心肌细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。Western blotting检测细胞Bim、Bax、Bcl-2和p-p38 MAPK和p38 MAPK蛋白的表达。结果:免疫组化鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。bim-siRNA转染均能有效沉默bim基因的表达(P<0.01),其中第2对沉默效率最高,达到86.73%。缺氧使心肌细胞的搏动频率显著减慢,节律不规则,而沉默bim基因的表达能使细胞搏动频率增加。缺氧损伤导致细胞培养液中LDH含量较空白对照组明显增加(P<0.01),心肌细胞存活率明显下降(P<0.05),细胞凋亡率较空白对照组明显增加(P<0.01),转染bim-siRNA后细胞培养液中LDH含量显著减少,细胞存活率升高,细胞凋亡率下降。缺氧损伤导致心肌细胞Bax和p-p38 MAPK表达升高(P<0.05或P<0.01),Bcl-2蛋白表达下降(P<0.01),bim-siRNA的转染能够抑制缺氧导致的上述改变(P<0.01或P<0.05),并且与心肌细胞凋亡发生率降低一致,p38 MAPK表达无明显变化。结论:沉默bim的表达能有效抑制缺氧导致心肌细胞凋亡的作用,其机制可能与抑制Bax、p-p38 MAPK的表达和增强Bcl-2蛋白表达有关,这有望为冠心病的治疗提供新方向。

摘要：背景:以往研究表明,心肌及血管局部组织中的肾素-血管紧张素系统激活参与了高血压及心血管重构的形成过程,但其是否通过氧自由基发生作用尚不明确。目的:观察抗氧化剂依布硒啉对长期给予一氧化氮合酶抑制剂硝基精氨酸甲酯大鼠的干预效果,分析氧自由基在一氧化氮缺乏所致高血压、心血管系统重构中的作用。设计:随机分组,对照动物实验。单位:南昌大学第二附属医院心血管内科,南昌大学心血管疾病研究所。材料:实验于2002-01/2003-03在南昌大学心血管病研究所动物实验室及医学分子中心实验室完成。选择雄性Wistar大鼠24只,按随机数字表法分为3组,每组各8只,即正常对照组、一氧化氮合酶抑制剂组和一氧化氮合酶抑制剂+依布硒啉组。方法:①正常对照组:常规饮食饮水,给予4g脱脂奶球。②一氧化氮合酶抑制剂组:将硝基精氨酸甲酯50mg/(kg·d)添加于4g脱脂奶球中喂食。③一氧化氮合酶抑制剂+依布硒啉组:将硝基精氨酸甲酯50mg/(kg·d)及依布硒啉30mg/(kg·d)分别添加于2g脱脂奶球中喂食。在大鼠给予硝基精氨酸甲酯前和喂药后1,2,4,6,8周末测收缩压。8周末麻醉后处死大鼠,取血浆及心尖部心肌匀浆测生化指标,其余心脏组织行病理学检测。主要观察指标:①各组大鼠血压动态变化情况。②各组大鼠血浆、心肌组织一氧化氮水平、超氧化物歧化酶及血管紧张素转换酶活性、心肌超氧阴离子生成率及心肌血管紧张素Ⅱ1型受体蛋白表达水平。③各组大鼠病理形态学检测指标。结果:24只大鼠全部进入结果分析,无脱失。①各组大鼠收缩压:给药后第1,2,4,6,8周末一氧化氮合酶抑制剂组大鼠收缩压逐渐升高,显著高于正常对照组同期收缩压(P<0.05～0.01);在给药后第8周末,一氧化氮合酶抑制剂+依布硒啉组收缩压显著低于一氧化氮合酶抑制剂组(P<0.05)。②各组大鼠血浆及心尖部心肌匀浆测生化指标:一氧化氮合酶抑制剂组心肌组织一氧化氮水平、超氧化物歧化酶活性均显著低于正常对照组(P<0.05～0.01),一氧化氮合酶抑制剂+依布硒啉组则显著高于一氧化氮合酶抑制剂组(P<0.05～0.01)。一氧化氮合酶抑制剂组心肌超氧阴离子生成率、血管紧张素转换酶活性、血管紧张素Ⅱ1型受体表达水平均显著高于正常对照组(P<0.05),一氧化氮合酶抑制剂+依布硒啉组则显著低于一氧化氮合酶抑制剂组(P<0.05)。③各组大鼠病理形态学检测指标:一氧化氮合酶抑制剂组及一氧化氮合酶抑制剂+依布硒啉组大鼠心脏质量/体质量比值、左心室厚度及小动脉腔径/壁厚比值均显著高于正常对照组(P<0.05～0.01),其中一氧化氮合酶抑制剂+依布硒啉组大鼠左心室厚度及小动脉腔径/壁厚比值均显著低于一氧化氮合酶抑制组(P<0.05)。结论:抗氧化剂依布硒啉能缓解一氧化氮缺乏所致的高血压及心血管重构。氧自由基可能通过促进血压升高及局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活,参与心血管重构效应,提示氧自由基在一氧化氮缺乏所致的高血压及心血管重构中可能发挥重要作用。

摘要：背景:研究表明,可溶性血管内皮生长因子受体Flt-1(sflt-1)基因在多种组织中表达,但其在内皮细胞中的表达尚待证实。目的:获取人sflt-1基因,构建sflt-1基因真核表达载体pEGFP-N1/sflt-1重组质粒,检测其在人脐静脉内皮细胞中的表达。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-05/12在南昌大学第二附属医院分子中心完成。材料:pEGFP-N1真核表达载体为南昌大学第二附属医院分子中心保存,人脐静脉内皮细胞株购至南京基凯生物技术公司。方法:从含有目的基因的质粒克隆模板中,利用酶切的方法获得目的基因,将目的载体进行酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,PCR鉴定为阳性的克隆,证明目的基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。用脂质体法将pEGFP-N1/sflt-1重组质粒转染人脐静脉内皮细胞。主要观察指标:①重组质粒的酶切鉴定结果。②重组质粒的测序鉴定结果。③荧光显微镜及蛋白免疫印迹检测sflt-1基因在人脐静脉内皮细胞中的表达。结果:①对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,与sflt-1基因片段全长2063bp理论值相符,证实pEGFP-N1/sflt-1重组质粒构建成功。②重组质粒送至上海捷瑞生物技术公司进行通测,测序结果证实插入片段序列与理论值完全一致。③荧光显微镜下可见重组质粒转染人脐静脉内皮细胞发绿色荧光,蛋白免疫印迹检测表明sflt-1基因能在人脐静脉内皮细胞中表达。结论:实验成功构建了携带人血管内皮生长因子受体Flt-1的重组pEGFP-N1/sflt-1真核表达质粒,并证实其在人脐静脉内皮细胞中的表达。

摘要：背景:各种外界应力对细胞增殖有重要作用,但涉及骨髓间充质干细胞最佳压力及加载时间的力学研究尚少。目的:探讨周期性压力培养对兔骨髓间充质干细胞增殖活性及细胞周期的影响。设计、时间及地点:细胞学体外对照实验,于2008-01/08在南昌大学重点分子生物实验中心完成。材料:健康6周龄雄性新西兰大白兔4只,由南昌大学实验动物中心提供。自行改制的细胞压力加载装置专利号ZL2006-2-0097266.3。方法:使用密度梯度离心法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取生长良好的第3代细胞,按4×104个/孔接种于6孔板,设立5组:5.32,10.64,21.28,29.26kPa压力组分别给予对应的压力,每日加压6h×3d;正常培养组细胞只接受正常大气压力学刺激,不予额外加压。主要观察指标:力学干预后,观察细胞形态及生长状况,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪测量细胞周期变化。收集细胞培养上清液,检测基质金属蛋白酶2的质量浓度。结果:6h/d压力干预骨髓间充质干细胞,3d后细胞形态无异常变化,呈集落样生长。随着周期性压力的增加,细胞吸光度值逐渐升高,以21.28kPa压力组为佳,但升高至29.26kPa压力时吸光度值明显降低(F=3.731,P=0.008)。与正常培养组比较,5.32,10.64,21.28kPa压力组细胞周期发生改变,增殖指数均明显升高(P<0.05或0.01),但29.26kPa压力组增殖指数则明显下降。细胞培养上清液基质金属蛋白酶2质量浓度21.28kPa压力组最低,29.26kPa压力组最高,组间比较差异有显著性意义(t=213.214,P<0.001)。结论:5.32～21.28kPa周期性压力可以提高骨髓间充质干细胞的增殖能力,特别是21.28kPa压力刺激促增殖作用尤为明显,但压力过强则抑制细胞增殖。