摘要：目的:探讨慢病毒介导的RNA干扰敲减泛素特异性肽酶39(ubiquitin specific peptidase 39,USP39)对人膀胱癌细胞生长和细胞凋亡的影响,为膀胱癌的治疗提供新思路。方法:RT-qPCR确定5637和T24细胞系中USP39 mRNA的表达;设计合成针对USP39的特异性shRNA,利用脂质体转染膀胱癌细胞后,RT-qPCR和Western blotting检测shRNA抑制效率;通过Celigo细胞计数测定、MTT法和集落形成能力检测细胞的增殖能力和集落形成能力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blotting检测凋亡标记物C-PARP1、p53、p-p53和C-Caspase-3的表达。结果:通过RT-qPCR和Western blotting分析确定,shRNA敲减后细胞中USP39的mRNA和蛋白质表达水平显著降低。通过MTT分析、集落形成分析和流式细胞术分析证实,USP39的敲减显著降低了膀胱癌细胞的增殖和集落形成能力,并诱导了细胞凋亡。此外,Western blotting分析表明,USP39基因敲减可能通过上调膀胱癌5637细胞中p53、p-p53、C-PARP1和C-Caspase-3的表达诱导细胞凋亡。结论:敲减USP39可通过激活Caspase级联反应和上调p53的表达来抑制膀胱癌细胞的增殖。这些数据可为开发USP39作为抗膀胱癌的潜在分子靶标提供实验依据。USP39可能是针对膀胱癌靶向治疗的新型生物标志物,需要进一步研究。

摘要：目的:设计、验证针对DNA甲基化转移酶3家族同源保守区域的多靶点siRNA,体内、外评价同时沉默DNMT3对肾细胞癌增殖、侵袭能力的影响。方法:基于DNMT3A/3B的同源保守区域,设计制作针对二者同源区域的2对siRNA序列(si DNMT3A/B-1及si DNMT3A/B-2),以Western印迹法验证沉默效率。转染肾细胞癌786-0细胞系后,分别以体外、体内实验验证其对于肾细胞癌增殖、侵袭能力的影响。结果:针对DNMT3A/B同源保守区siRNA序列,能够显著降低DNMT3A及3B的蛋白表达,并可以显著降低786-0细胞划痕迁移、增殖、侵袭能力,其侵袭、增殖关键基因(Ki-67、Vimentin、VEGF、CD31、MMP2)表达显著下调。体内研究证实,敲除组小鼠皮下瘤生长速度显著降低伴总体生存率显著延长(P<0.05),且皮下瘤内侵袭、增殖关键基因表达显著下调(P<0.05)。结论:基于DNMT3同源保守区域可获得多靶点有效siRNA;靶向下调肾细胞癌786-0细胞系DNMT3A及3B表达能够显著降低细胞增殖、侵袭能力;靶向DNMT3是肾细胞癌治疗的潜在靶点。

摘要：目的:探讨基质金属蛋白酶MMP-10在人膀胱癌细胞体外侵袭中的作用。方法:设计并合成针对MMP-10的siRNA和阴性对照siRNA,以脂质体转染法将其分别导入具有体外高侵袭潜能的T24细胞系,RT-PCR和Western blot法检测MMP-10基因及蛋白表达水平。Transwell体外侵袭实验比较干扰MMP-10前后T24细胞体外侵袭潜能的变化。结果:MMP-10-siRNA可有效沉默MMP-10基因的表达,并降低T24细胞系的体外侵袭能力。结论:MMP-10可能在膀胱癌侵袭转移过程中发挥重要作用,抑制MMP-10可为预防及治疗转移性膀胱癌提供新的思路。

摘要：杭州市之所以被誉为"生态文明之都"源于生态文明制度建设走在全国前列。其基本经验有:始终坚持以生态空间管制制度保障城市与自然相互融合的组团式的城市规划理念,始终坚持在继承中创新生态文明制度及生态文明制度体系,始终坚持在协调中推进生态文明制度的相互补充和配合,始终坚持在上下级和上下游的衔接中进行生态文明制度整合,始终坚持以研究为基础推进生态文明制度建设,始终坚持以生态文明制度保障生态环境治理体系与治理能力现代化的建设。但是,杭州市生态文明制度设计中依然缺乏绩效引领,有些制度存在彼此冲突,往往存在制度拥挤,有时还存在制度缺位等问题。因此,要基于制度的替代性加强生态文明制度选择,基于制度的互补性加强生态文明制度耦合,基于制度的冲突性加强生态文明制度协同,基于制度的空缺性进行生态文明制度的查漏补缺,基于评价的定性化健全生态文明制度绩效定量评价制度。

摘要：目的:探讨敲减MMP-10对人膀胱癌T24细胞系裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法:设计并合成针对人MMP-10的siRNA及阴性对照siRNA,分别注射至裸鼠皮下膀胱癌T24细胞系移植瘤,每周两次监测并比较各组裸鼠体重、瘤体大小,于接种后第5周处死裸鼠,取出皮下移植瘤,并比较各组瘤体重量的差异,并通过免疫组织化学染色检测MMP-10表达水平。结果:皮下注射膀胱癌T24细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤率达100%。瘤体内注射MMP-10 siRNA可以显著抑制膀胱癌T24细胞裸鼠皮下移植瘤的生长(P0.05),提示瘤体内注射MMP-10 siRNA对裸鼠的一般情况影响不大,并没有明显的毒性或副作用。免疫组织化学染色结果示MMP-10 siRNA组MMP-10的染色强度及阳性细胞数均明显低于普通成瘤组和阴性对照组,提示瘤体内注射siRNA可以在体内有效敲低MMP-10的表达。结论:MMP-10在人膀胱癌T24细胞裸鼠皮下移植瘤的生长过程中发挥重要作用;瘤体内注射MMP-10 siRNA可以有效且安全地抑制膀胱癌T24细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。