摘要：目的构建靶向Pin1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰真核表达质粒,并检测其对大肠癌SW620细胞Pin1基因的抑制作用。方法设计合成特异性针对人Pin1基因的寡核苷酸序列,退火后与pGenesil-1载体连接,构建靶向Pin1基因的shRNA真核表达质粒pGenesil-1-Pin1(+),利用脂质体转染大肠癌SW620细胞,以质粒pGenesil-1-Pin(-)转染细胞和未转染细胞为对照。利用荧光显微镜观察转染后细胞表达的绿色荧光蛋白,估算转染效率;应用实时荧光定量PCR和Western blot检测其对SW620细胞Pin1基因mRNA转录及蛋白表达的影响。结果所构建的特异Pin1shRNA真核表达质粒经酶切及测序证明构建正确,转染SW620细胞的转染效率为64%。shRNA对SW620细胞Pin1基因mRNA的抑制率在转染后72h最高,为70.2%,蛋白抑制率为60%。结论已成功构建了靶向Pin1基因的shRNA干扰真核表达质粒,可抑制SW620细胞Pin1基因mRNA的转录及蛋白的表达。

摘要：为了研究去整合素echistatin RGD(Arg-Gly-Asp)模体周边氨基酸突变后对其生物学功能的影响,根据echistatin序列设计合成6个片段,利用重叠延伸PCR法合成cDNA,使echistatin RGD模体周边序列变为ARGDNM(D27→N),与载体pTXB1连接后转化***21(DE3),建立echistatin(ARGDNM)的表达体系.工程菌经IPTG诱导后融合蛋白表达量占菌体总蛋白约30%,几丁质亲和纯化后,DTT裂解释放目的蛋白分子量约5.4kD.体外血小板聚集和体内鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)血管新生实验结果表明,echistatin(ARGDNM)抑制血小板聚集的作用减弱,而其抑制血管新生的作用增强.RGD模体周围氨基酸的改变影响了去整合素的生物学功能,echistatin(ARGDNM)增强了与αⅤβ3结合的特异性,本工作为研究特异性更强的去整合素药物奠定了基础.

摘要：目的 为获得重组人肝细胞生长因子β(rhHGF-β)的高效表达体系,分离纯化rhHGF-β,以期研究其在生物学和医学中的作用。方法 从人胎肝组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术,对HGF-β基因加工修饰,与载体PBV220重组,构建rhHGF-β的表达载体,转化大肠杆菌,筛选rhHGF-β的高效表达菌株。对rhHGF-β进行粗纯化,透析复性后MTT法检测生物活性。结果 获得了rhHGF-β完整的cDNA序列,重组克隆的酶切结果与设计一致。目的 蛋白的表达量占全菌蛋白的30％,粗纯化后纯度达90％,复性产物能刺激大鼠肝细胞的增殖。结论 建立了rhHGF-β的表达体系,获得了具有生物活性的rhHGF-β,为进一步大量制备和研究HGF的生物学功能提供了重要的实验数据。

摘要：目的探讨四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction,tetra-primer ARMS-PCR)在SNP基因分型中的应用。方法利用人EXO1基因第10外显子C49T单核苷酸多态性为研究对象,以tetra-primer ARMS-PCR的原理设计四种引物进行扩增,从而对Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶用量及内外引物浓度比例4个因素进行优化。结果当反应体系的退火温度为51℃,Mg2+浓度、dNTP浓度分别为2.0mmol/L、0.1mmol/L,Taq酶用量为0.5U,内/外引物浓度为1/0.2μmol/L时,tetra-primer ARMS-PCR应用于该SNP位点的基因分型结果最佳。结论四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应是SNP基因分型的一种可行方法,但在应用时需对反应条件进行必要的优化。

摘要：以细胞膜穿透肽 (Penetratin)基因为主要模板序列 ,融合肝细胞膜受体结合蛋白的DNA序列 ,设计一段肝细胞基因治疗载体的特异基因序列 ,构建并表达了肝细胞特异性载体体系及 3种对照体系。然后进行肝细胞的穿膜实验 ,细胞荧光显色结果提示肝细胞特异性载体体系可以有效地介导外源蛋白EGFP的基因进入肝细胞 ,并在肝细胞内表达。结论提示 ,所构建的载体体系有可能为肝细胞基因治疗提供一种新型的非病毒基因治疗载体。

摘要：构建人胰岛素原突变体GIRR(A2 1Asn→Gly,B1 7Leu→Ile ,B31Arg ,B32Arg)基因的原核融合表达载体并进行表达和纯化 ,进一步对其性质进行研究。将人胰岛素原突变体基因重组到pTXB1融合表达载体上 ,在E .coliBL2 1 (DE3)中得到高效表达。表达产物经几丁质亲和柱层析分离以及胰蛋白酶和羧肽酶B的酶促转化等步骤 ,得到纯的人胰岛素突变体GIRR ,其纯度经HPLC鉴定达到 95 % ,氨基酸组成和设计相符 ,其受体结合活性是猪胰岛素的 1 0 5 % ,生物活性为 2 6 8IU mg。其血浆半衰期为 2 0分钟 ,比标准猪胰岛素提高 3倍多。结果提示本突变体具有更长的半衰期 ,为长效胰岛素的制备提供了新的思路。

摘要：目的 pu22寡核苷酸序列作用于VEGF基因使VEGF启动子区形成G-四链体,干扰VEGF基因的表达从而促进HCT116细胞和SW480细胞的凋亡。方法设计合成的pu22和mutpu22摄取到细胞后,在pu22不同浓度作用下,通过实时定量PCR实验检测VEGF基因的表达情况,利用免疫印迹实验检测VEGF蛋白表达水平;通过细胞凋亡实验检测两种结肠癌细胞凋亡的情况。结果荧光实时定量PCR与免疫印迹实验结果显示处理组的两种结肠癌细胞株HCT116与SW480用8μL/L的PU22处理48 h后VEGF的表达最低,其相对表达值均显著低于正常细胞组及空白对照组。细胞凋亡实验结果表明两种细胞处理组凋亡率均大于相应的正常组与对照组。结论寡核苷酸序列PU22对杀伤结肠癌细胞起着显著的作用。

摘要：目的　构建重组人肝细胞生长因子 β(rhHGF β)的克隆表达体系。以期进一步研究HGF基因的表达调控及HGF的生物学、医学作用。方法　从人胎肝组织中提取总RNA ,运用RT PCR技术 ,对HGF β基因转录前加工修饰 ,与载体重组 ,构建rhHGF β的克隆。并对克隆进行限制性内切酶酶切图谱分析 ,对重组体中插入的外源基因进行序列分析。 结果　获得了rhHGF β完整的cDNA序列 ,重组体克隆的酶切结果与设计一致。 结论　首次成功地构建了人肝细胞生长因子 β(rhHGF β)的克隆表达体系。

摘要：目的　定点突变法扩增制备完整hHGF αcDNA ,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果　以含有人HGFcDNA全序列的质粒 pRC/CMV hHGF为模板 ,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应 (PCR) ,扩增hHGF αcDNA基因 ,琼脂糖凝胶电泳检测 ,结果显示扩增得到了 1 34kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶XhoⅠ酶将其切为 386bp、95 4bp两个片段 ,分别以EcoRⅠ /XhoⅠ、XhoⅠ /BamHⅠ与 pBSKS载体连接重组 ,对目的基因分段克隆后进行序列测定 ,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoRⅠ、BamHⅠ识别位点外 ,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGFcDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoRⅠ /XhoⅠ、XhoⅠ /BamHⅠ从pBSKS HGF α 386、pBSKS HGF α 95 4中切出的 386bp、95 4bp两个片段以EcoRⅠ /BamHⅠ与pBV2 2 0连接构建重组表达质粒 pBV2 2 0 HGF α ,限制性内切酶图谱分析显示HGF αcDNA插入到载体pBV2 2 0的EcoRⅠ /BamHⅠ位点 ,插入方向正确。温度诱导表达 ,SDS PAGE显示一分子量与单体hHGF α链吻合的蛋白带 ,证明表达质粒构建成功。结论　设计制备了hHGF α链cDNA ,克隆建立了hHGF α链原核表达质粒。