摘要：为了探讨不同位点siRNA在不同时间点对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中hTERT mRNA表达的抑制作用,设计并化学合成4对针对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的特异性siRNA。以脂质体法转染入MCF-7细胞,在转染后12h、24h、48h、72h和5d,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中hTERT mRNA的表达。与对照组相比,4段siRNA中有3段在转染后12h即对hTERT mRNA的表达产生抑制,48h抑制率最高,72h后下降,其中位于hTERT mRNA二级结构中的结构相对简单区域的siRNA抑制率最高,达到75%,说明特异性siRNA对hTERT基因有明显的抑制效果,且该抑制效应具有位置及时间依赖性。

摘要：目的设计合成干扰端粒重复序列结合因子2(telomeric repeatbinding factor 2,TRF2)基因表达的不同小型干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制TRF2基因表达的siRNA。方法根据人TRF2 mRNA的序列,设计合成3对不同的针对TRF2的siRNA、应用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂将三对siRNA转染人乳腺癌MCF-7细胞,实时荧光定量RT-PCR技术检测TRF2 mRNA表达水平、Western印迹法检测TRF2蛋白表达以确定干扰效果。结果设计合成的3对TRF2 siRNA中有2对siRNA可有效抑制TRF2基因表达。结论成功设计合成了针对TRF2基因的siRNA,并从中筛选出能特异且高效阻断TRF2表达的siRNA,为进一步应用RNAi技术抗TRF2基因进行肿瘤基因治疗研究奠定实验基础。

摘要：目的构建人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,探讨该载体对人乳腺癌MCF-7细胞生长及hTERT基因表达的影响。方法设计针对hTERT基因的干扰靶序列,构建siRNA重组表达质粒pGenesil-hTERT,将该质粒酶切测序鉴定后,以脂质体转染MCF-7细胞,RT-PCR和Western blot技术分别检测hTERT基因及其蛋白的表达,MTT法观察转染后MCF-7细胞生长情况。结果酶切电泳和测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。该质粒转染MCF-7细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平均显著降低,MCF-7细胞生长抑制。结论内源性短发夹状siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖生长,这也为肿瘤的基因治疗提供了实验依据。

摘要：目的:探讨构建带有肿瘤特异性Survivin启动子的PUMA基因表达载体pUC57-Survivin-PUMA对乳腺癌MCF-7细胞的肿瘤特异性促凋亡作用。方法:化学合成PUMA基因片段克隆至pUC57质粒,构建重组质粒pUC57-PUMA;克隆Survivin启动子序列,取代pUC57-PUMA质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pUC57-Survivin-PUMA,测序鉴定。实验设置pUC57-PUMA组、pUC57-Survivin-PUMA组、阴性对照组(pUC57group)和空白对照组(blank group)。将以上各组分别转染人乳腺癌MCF-7细胞及人正常乳腺Hs 578Bst细胞。转染后48h,western blot技术检测各组细胞中PUMA蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:重组质粒经测序鉴定证实符合设计要求,构建成功;MCF-7细胞中pUC57-PUMA组和pUC57-Survivin-PUMA组的PUMA蛋白表达均较对照组显著增高(P<0.05),而人正常乳腺Hs 578Bst细胞中只有pUC57-PUMA组的PUMA蛋白表达较其他3组显著增高(P<0.05)。MCF-7细胞中pUC57-PUMA组和pUC57-Survivin-PUMA组的细胞凋亡率分别为29.02%和29.31%,均较对照组显著增高(P<0.05),而人正常乳腺Hs 578Bst细胞中仅pUC57-PUMA组的细胞凋亡率较其他3组显著增高(P<0.05)。结论:Survivin启动子调控的PUMA表达载体能显著增高乳腺癌MCF-7细胞中PUMA的表达,进而促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡,而对正常乳腺Hs 578Bst细胞的凋亡不产生影响。

摘要：目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,并研究该载体对乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响,为针对端粒酶的乳腺癌基因治疗提供新的途径。方法设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA,构建重组siRNA表达质粒pGenesil-hTERT,同时构建不针对任何基因的阴性对照重组pGenesil-HK。两种重组质粒经酶切、电泳分析和测序鉴定后,用脂质体转染法分别转染乳腺癌MCF-7细胞,应用端粒酶重复序列扩增聚合酶链反应(TRAP-PCR)及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。转染pGenesil-hTERT的MCF-7细胞,凝胶电泳见端粒酶特征性条带明显减少,端粒酶活性受到明显抑制;pGenesil-hTERT转染细胞后凋亡率较对照组明显升高(P<0.01),且转染48h凋亡率最高,达54.7%±2.41%。结论hTERT-siRNA可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性、促进细胞凋亡,此法有望应用于肿瘤基因治疗。

摘要：构建实验教学质量监控体系是高校教学管理的一个重要环节。本文以临床本科医学细胞生物学实验教学过程为研究对象,对构建医学细胞生物学实验教学质量监控体系进行了分析,并围绕提高实验教学质量提出了具体的措施。

摘要：目的:构建带有肿瘤特异性Survivin启动子、hTERT基因靶向的shRNA表达载体pYr-Survivinp-miR30-hTERT,探讨该载体的肿瘤靶向性及其RNAi作用效率,为RNAi技术在肿瘤基因治疗中的进一步优化进行有益的探索。方法:化学合成hTERT基因shRNA寡核苷酸序列,克隆至质粒pYr-CMV-Mir30-shRNA,构建重组质粒pYr-CMV-Mir30-hTERT;克隆Survivin启动子序列,取代该质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pYr-Survivinp-miR30-hTERT,同时构建阴性对照质粒pYr-CMV-Mir30-NC,以上质粒均进行酶切及测序鉴定。将以上载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞及293T细胞,荧光显微镜下观察细胞转染情况,并采用半定量RT-PCR、western blot技术检测MCF-7细胞和Hela细胞中hTERT mRNA和蛋白的表达。结果:重组质粒经酶切及测序鉴定证实均符合设计要求,构建成功;荧光检测结果表明,CMV组在三种细胞中均有荧光蛋白的表达,而Survivin组质粒仅在MCF-7细胞和Hela细胞中表达绿色荧光,转染效率均能达到70%以上,而在293T细胞中则未见荧光;RT-PCR和Western blot的结果均显示MCF-7细胞和Hela细胞的Survivin组和CMV组中hTERT mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制(P0.05)。结论:Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体能有效抑制Survivin阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,而对正常细胞不产生影响。

摘要：目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰表达载体,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达的影响。方法:设计针对hTERT基因的干扰靶序列并构建重组siRNA表达载体pGenesil-hTERT。酶切测序鉴定后,脂质体转染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Weston Blot法检测hTERT基因的表达情况,应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功,且转染MCF-7细胞后,hTERT mRNA和蛋白质表达水平显著抑制,细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.01)。结论:以DNA质粒为载体的siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞生长、促进细胞凋亡。

摘要：目的:构建带有肿瘤特异性DF3启动子、针对hTERT基因的RNA干扰表达载体pGenesil-10-miR30-DF3-hTERT,探讨该表达载体的肿瘤靶向性基因抑制作用。方法:分别用针对hTERT基因的RNA干扰寡核苷酸序列及DF3启动子取代质粒pGenesil-10-Micro30中原有的miR30序列及CMV启动子,构建pGenesil-10-miR30-DF3-hTERT载体并进行酶切及测序鉴定。将该载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞及造血干细胞,ELISA法检测hTERT蛋白的表达情况。结果:重组质粒经酶切及测序鉴定证实符合设计要求,构建成功。ELISA法检测结果显示,实验组MCF-7细胞及HepG2细胞的hTERT蛋白下降显著(P0.05)。结论:DF3启动子调控的hTERT基因的RNA干扰表达载体能有效抑制DF3阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,以乳腺癌细胞效果最为显著,而对端粒酶阳性的正常细胞不产生影响。

摘要：实验教学是本科教学的重要组成部分。对培养学生的动手能力、实践技能、科学素质和创新能力有着不可替代的作用。随着高校教育教学改革的进一步深入发展。开展对实验教学质量评价的研究，建立一套与实验教学管理、发展相适应的．行之有效的实验教学质量监控体系，推动实验教学的改革和发展，提高实验教学质量就显得尤为重要。