摘要：噬菌体,以杀菌特性而闻名的天然病毒,是地球上多样性和丰度最高的生物体。在过去100多年中,噬菌体的研究极大地推动了遗传学、分子生物学和合成生物学的发展。随着耐药超级细菌的流行,噬菌体疗法引人入胜的科学历史也被广为传颂。然而,相对于自然环境中丰富的噬菌体数量(总数为10^(31),比所有其他生物的总和还要多),目前只有少数噬菌体成功应用于对抗耐药性细菌感染及其他工程领域。当前,急需践行合成生物学从“造物致知”到“造物致用”理念,采用高通量测序和基因组精准编辑等先进生物技术来创建具有独特属性的增强变体,提高噬菌体治疗的疗效和可编程性。本文综述了近年来噬菌体基因工程改造方法的技术进展以及合成生物学助力噬菌体应用技术发展的研究动态,如按照实际需求改造噬菌体宿主范围、借助宏基因组挖掘自然界中噬菌体的广泛资源、结合多组学技术揭示噬菌体与宿主互作的分子机制、调控肠道噬菌体组维持肠道稳态以促进人体健康及利用大数据和新型人工智能指导噬菌体理性设计。总之,合成生物学正在跨时代驱动传统实验研究范式转变,结合“设计—构建—测试—学习(DBTL)循环”理性设计目标噬菌体,无论是自上而下的体系优化,还是自下而上的生命体重构,工程噬菌体的合成生物学“智造”都大有可为。

摘要：目的　用随机PCR技术制备构建靶基因文库的随机基因片段。方法　先扩出靶基因 (HIV1Envgp160 )片段 ,然后设计两条引物 ,1条为锚定随机引物用于扩出靶基因的随机片段 ,另 1条为锚定特异引物用于对随机片段进行扩增 ,得到大量的随机片段 ;优化模板量、dNTP浓度、反应时间、温度和DNA聚合酶等反应条件 ,扩出靶基因的随机片段。结果　得到用于建库的理想靶基因随机片段。结论　随机PCR是制备靶基因文库随机片段的一个简便有效方法。

摘要：利用"设计限制酶辅助突变"(Designed Restriction Enzyme Assisted Mutagenesis,DREAM)进行全长质粒快速定点突变。根据突变位点附近氨基酸靶序列,以简并密码子进行逆向推导,这样在不改变氨基酸序列的前提下可以得到数目巨大的隐性突变体(Silent mutants),这些突变体中包含大量的限制性酶切位点,选择合适的酶切位点设计引物,用Phusion超保真DNA聚合酶扩增全长质粒的DNA序列,得到的PCR产物用T4多聚核苷酸激酶添加5′磷酸基团后进行平末端连接,转化大肠杆菌受体菌后用设计的酶切位点进行快速筛选。本研究用该方法成功地纠正了长约8 kb的质粒pcDNA3.1-pIgR中的突变碱基,从而获得了多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的野生型氨基酸序列。以上结果表明:利用DREAM技术将限制性酶切位点引入目的基因而不改变目的蛋白质的氨基酸序列,使突变体的筛选简单化;配合使用高保真和高效率的Phusion DNA聚合酶可以进行长达8 kb的全长质粒的快速突变;该方法无需使用定点突变试剂盒和特殊的受体菌,同时避免了核酸杂交以及同位素的使用。

摘要：基于重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法建立特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法。优化设计合成溶葡球菌酶序列,构建重组表达载体pQE30-Lys,转化至大肠杆菌M15并诱导表达,镍柱纯化得到目的蛋白。利用重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法特异定量检测金黄色葡萄球菌并与平板计数对比。成功表达了重组溶葡球菌酶,并建立了特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法,与平板计数具有显著线性关系。本研究建立的将重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法相结合的检测方法操作快捷简单,具有良好的应用前景。

摘要：目的:建立基于DREAM设计和同源重组的简便、快速定点突变方法。方法:设计两条包含突变的反向PCR(inverse PCR)引物,使其5′端互补从而产生同源重组,同时使用DREAM设计方案在上述引物中引入限制性内切酶位点以便突变子筛选。用能扩增长片段的高保真耐热DNA聚合酶扩增全长的质粒DNA,直接转化大肠杆菌。转化到细菌中的全长质粒DNA PCR产物可利用其末端同源序列发生同源重组而环化。利用引入的酶切位点方便地进行突变子的筛选。结果:用该方法成功地对长度大于7kb的质粒进行了定点突变。结论:本定点突变无需任何突变试剂盒和特殊的试剂,只需一步反应即可完成;利用DREAM设计使克隆筛选简便可靠,高保真耐热DNA聚合酶可保证多数突变子克隆不发生意外突变,而该酶扩增长片段的能力使该方法适合于大多数质粒不经亚克隆直接突变。

摘要：通过实验设计和数据分析,筛选出尽可能真实反映含量较低的皮肤微生物群落的高通量测序分析方法。使用多因素多水平完全随机实验设计,分析DNA提取、PCR扩增、样品采集、测序过程中各种实验因素对微生物群落组成特征分析结果的影响。结果显示,在样品采集方面,筛选出了最佳的采集拭子与采集液体;在DNA提取方面,筛选出了最佳的前处理方法及试剂盒种类;在PCR反应方面,筛选出了最佳的模板浓度及退火温度;在测序方面,筛选出了合适的测序深度。通过一系列的实验条件筛选,确定了适合分析低含量细菌群落结构组成特征的方法,并成功地应用于人类手掌面皮肤。

摘要：以杆状病毒 -昆虫细胞表达系统Bac-to -Bac为模型 ,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨。根据核心蛋白的亲水性分析结果 ,设计了三种长度的基因片段 (C173 、C191和C2 15) ,经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染 ,获得三种重组病毒 (rvBACC173 、rvBACC191和rvBACC2 15)用于表达分析。SDS -PAGE电泳和免疫印迹试验表明 ,昆虫细胞能够识别核心蛋白第 191和 192位氨基酸之间的切点并低效率切割 ;但不能够识别 173～ 191位之间的切点。间接免疫荧光试验表明 ,截断型核心蛋白C173 定位于细胞核内 ,而C191和C2 15则停留在细胞浆中。rvBACC173 感染的细胞在核内出现单一的“类晶体样结构” ,电子显微镜分析证实 ,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体。试验结果还表明 ,第 173至 191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达 ,并且影响蛋白在细胞内的分布。间接ELISA实验证实 。

摘要：目的:介绍一种简便、有效的定点突变技术。方法:根据突变位点附近的DNA序列推导出氨基酸序列,再以此氨基酸序列进行逆翻译,这样在不改变氨基酸序列的前提下可以得到数目巨大的隐性突变(silent mutations),这些突变中包含大量的限制性内切酶位点,选择合适的酶切位点,自酶切位点向两侧合成引物(其中仅一个引物含有突变),用这些引物扩增两侧DNA片段(其中仅一个片段含有突变),然后将这两个片段以相应的内切酶切割后融合即可完成定点突变。结果:用该方法成功地纠正了人工合成的可溶性组织因子基因中两个碱基的缺失,校正了阅读框架,获得了预期的目的基因。结论:该方法简便、有效,突变成功率高,适合于在一般分子生物学实验室使用;该方法能避免了因多轮PCR和合成长引物导致突变的可能性,可作为一种定点突变的替代方法。这种改进的PCR定点诱变技术我们称之为“设计限制酶辅助突变”(Designed Restriction Enzyme Assisted Mutagenesis,DREAM)。

摘要：目的:克隆分泌型IgA(SIgA)相关基因——J链基因(IgJ)、多聚免疫球蛋白受体基因(pIgR)和IgA重链恒定区基因(IGHA),为进一步构建SIgA真核表达质粒奠定基础。方法:采用"基因组DNA剪接"技术,根据已发表的IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列,通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物,从人外周血基因组DNA中直接扩增各基因的外显子序列;然后人工设计融合相邻外显子的融合引物,采用重叠PCR技术,把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列,完成基因组DNA的体外剪接。扩增的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector中,通过DNA测序对阳性克隆进行分析鉴定。结果:PCR扩增的IgJ、pIgR和IGHA基因与预期大小一致;测序结果表明实验获得的上述基因与GenBank中的目标基因序列完全一致。结论:通过基因组DNA剪接技术成功克隆人类SIgA3个相关基因,提示此技术是合成多外显子cDNA的有效手段。

摘要：第一代移动生物安全三级实验室（移动P3）是按照国标GB19489—2004《实验室生物安全通用要求》标准设计建设，其主体由2台车载方舱组成。展开使用时，主、辅舱通过桥接形成“三区两缓”的整体结构，实现其高等级生物安全防护的功能。生物战、生物恐怖袭击以及自然原因所致疫情突发时，移动P3能够及时抵达现场，就地展开烈性病原体相关的实验室工作，弥补中心实验室与疫情现场距离过远、延误病原体分离检测时机的问题。