摘要：根据GenBank发表的XJ-MSA-2c核苷酸序列(登录号:EU328267)设计的2对特异性引物MS-1、MS-2、MS-3以及MS-4,建立牛巴贝斯虫病巢式PCR快速检测方法。在特异性检测试验中,仅从MSA-2c质粒样本中扩增出622、350bp2条目的片段,与预期片段大小相符,而作为对照样本的双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、东方巴贝斯虫基因组DNA均无此扩增目的条带出现。第1次和第2次扩增的敏感性分别为1.75、1.75×10-2μg/L。在对46份全血的DNA样本巢式PCR和显微镜检测中,阳性检出率分别为34.8%(16/46)和23.9%(11/46)。结果表明,所建立的巢式PCR方法准确、敏感、特异,作为牛巴贝斯虫病的快速检测和小范围的流行病学调查,具有重要的临床意义。

摘要：通过设计牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白HSP20基因序列的特异性引物,采用PCR方法从疑似"牛焦虫病"的患牛全血基因组中扩增得到699 bp的HSP20基因,将其连入pMD18-T测序、鉴定,再将验证的699 bp的HSP20基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核载体PCDNA3.1-HSP20。经再次测序、鉴定后,尾静脉注射小白鼠进行HSP20基因的瞬时表达,取其肝脏提取总RNA,经RT-PCR方法扩增出一条534bp的目的条带,表明真核表达质粒构建成功。

摘要：【目的】构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从疑似犬瘟热病犬全血样品中扩增CDV N蛋白基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。经测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达CDV N蛋白基因,8 h取其肝脏提取总RNA,进行RT-PCR方法扩增。【结果】在病犬的全血样品中扩增得到1 572 bp的CDV N蛋白基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CDV N,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带。【结论】构建了犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达。

摘要：【目的】建立CPIV的RT-PCR检测方法。【方法】从临床上疑似犬副流感(CPI)的犬鼻腔分泌物中提取CPIV总RNA。根据Genebank中收录的CPIV(序列号AY581307)中NP基因保守序列,设计一对特异性引物,扩增出667 bp片段,以此建立CPIV的RT-PCR检测方法。【结果】特异性试验表明该引物不能扩增犬其它常见的传染病病毒基因。敏感性试验表明该引物能检测到10^(-6)的CPIV总RNA量。重复性试验表明该引物具有良好的稳定性和重复性。对临床采集的32份样品进行RT-PCR检测时,阳性率为53.12%。【结论】实验建立了CPI的RT-PCR检测方法,可适合于临床CPIV的早期快速诊断和小规模的分子流行病学调查。

摘要：【目的】以期建立犬细小病毒巢式PCR诊断方法。【方法】根据基因库已发表的CPV VP2基因序列设计二对巢式引物,以临床上疑似CPV感染的犬粪样品中提取的总DNA作为模板,用巢式PCR方法扩增出CPV VP2基因的目的条带。【结果】扩增出的目的基因与国际标准序列的同源性为99.3%～100%。特异性试验发现该引物不能启动犬其它常见病毒基因的扩增。敏感性试验表明该引物能检测到10-9的CPV总RNA量。重复性试验显示该引物具有良好的稳定性。对采集的26份样品进行CPV巢式PCR检测,20份样品为阳性,阳性率为76.9%。【结论】建立的CPV的RT-PCR检测方法可于临床CPV的快速诊断和小规模的分子流行病学调查。

摘要：【目的】构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础。【方法】根据CPVVP2基因序列设计特殊引物,采用PCR方法从疑似"犬细小病毒"的患犬粪便基因组中扩增VP2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达VP2基因,8 h后取小白鼠肝脏提取总RNA,进行RT-PCR扩增。【结果】在病犬粪便基因组中扩增得到1 755 bp的VP2基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-VP2,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带。【结论】成功构建了犬细小病毒VP2基因真核表达重组质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达。

摘要：从患牛焦虫病的牛全血样品中抽提总RNA,通过设计特异性引物,经RT-PCR扩增牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白20(HSP20)基因的外显子,将其插入pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体PGEX-4T-2-HSP20(exon)。试验结果显示牛双芽巴贝斯虫HSP20基因外显子已被成功克隆。该基因的外显子序列与国际标准株HSP20外显子的序列存在两个碱基的突变,导致其编码的蛋白质出现了一个氨基酸的变异。测序结果还表明,克隆出的牛双芽巴贝斯虫HSP20基因外显子已正向插入原核质粒表达载体PGEX-4T-2,成功构建了PGEX-4T-2-HSP20(exon)表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中的得到表达。

摘要：本研究为高效构建狂犬病SRV9ψ区缺失株感染性cDNA克隆,在细胞内进行重组狂犬病病毒的拯救提供帮助。按照Isothermal in vitro recombination system or"Gibson Assembly"连接方法设计引物,分别扩增得到去除狂犬病SRV9标准疫苗株的伪基因区(ψ区)的首尾均存在互补序列的5个结构蛋白基因的目的片段。利用T5核酸外切酶、DNA聚合酶及T4连接酶的协同作用,两步即可获得狂犬病SRV9ψ区缺失株的感染性cDNA。本研究利用Gibson Assembly连接法成功高效构建了狂犬病SRV9ψ区缺失株的感染性cDNA。此方法避免了传统的酶切连接方法中繁琐的实验步骤,实现了多个基因片段间的无缝连接,大大提高了载体构建的效率,为进一步研究狂犬病病毒的基因功能提供高效的方法。同时也为Gibson Assembly法应用于其它载体的构建提供借鉴。

摘要：应用Gibson Assembly连接法精确快速构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆,为狂犬病病毒感染性cDNA克隆的构建提供新的方法。应用Gibson Assembly连接法在同一反应体系内,将多个片段和经限制性内切酶线性化的载体,按设计的顺序进行连接,实现多个片段的一步组装。设计带有20bp^30bp重叠序列的PCR引物,扩增得到带有重叠序列的狂犬病病毒5个结构蛋白基因和增强型荧光蛋白基因。扩增的片段和线性化的载体经胶回收纯化后,与Gibson连接液混合后,50℃反应60min,连接产物转化Stbl3感受态细胞,提取重组质粒,经PCR、酶切和测序鉴定,缺失了病毒伪基因Ψ区和糖蛋白基因的跨膜区并且将增强型荧光蛋白基因插入糖蛋白基因终止密码子前,构建了全长17 600bp的重组质粒,完成了重组全长感染性cDNA克隆的构建。

摘要：【目的】重组狂犬病病毒SRV9株磷酸化蛋白的P基因和基质蛋白的M基因,为构建狂犬病毒(SRV9)全长c DNA提供技术支撑。【方法】设计重组PCR引物,分别扩增SRV9的P基因和M基因,构建重组质粒p MD18-PM,并对重组质粒进行酶切、测序鉴定。【结果】PCR扩增的SRV9的P基因和M基因大小分别为893 bp和608 bp,与Gen Bank已发表的狂犬病病毒SRV9(登录号:AF499686)序列比较,同源性分别为99.66%和99.67%。融合基因PM片段大小为1 501 bp,与预期大小相同,且融合完全。【结论】应用重组PCR成功融合狂犬病病毒SRV9磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因,为后续构建病毒全长c DNA及感染性克隆奠定基础。