摘要：背景:抗氧化剂法及细胞因子法是体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元的2种方法,怎样选择既可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂?通过广泛筛选,应用中药干预脐血间充质干细胞的体外纯化、扩增并向神经元细胞分化。目的:观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用。设计,时间,地点:随机对照,细胞学体外观察,于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成。材料:年龄为23～35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份;黄芩苷,纯度>95%,由中南大学湘雅医学院药剂科提供;抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品。方法:采集胎儿脐带血,肝素抗凝,分离出脐血单个核细胞,调整细胞浓度为1×109L-1,以含体积分数为20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子、干细胞因子的DMEM液体培养基进行纯化和扩增。按照抗氧化添加剂的不同分为4组:黄芩苷组加入黄芩苷;空白对照组不添加抗氧化剂;β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇;共培养组添加黄芩苷、β-巯基乙醇。连续培养4周。主要观察指标:①脐血冷冻保存后7,14,21,28dCD34及CD29阳性细胞的表达。②细胞形态学观察。③流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志。④免疫细胞化学染色观察间充质干细胞扩增培养4周后神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达。结果:①与冻存前相比,冻存后7,14,21,28d脐血单个核细胞锥虫蓝拒染率均明显降低(P<0.05)。②细胞形态学观察:脐血单个核细胞培养第2～3天开始贴壁生长,2周左右达高峰,3周后细胞生长达80%～90%融合,此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形。4周后,黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩,细胞边缘出现细的突起;一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形,伪足有多个细长突起。β-巯基乙醇组、共培养组有少量细胞存在脱落、死亡现象,且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势。③培养4周后,空白对照组以CD45阳性细胞为主;其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主,其中共培养组最多,黄芩苷组次之,β-巯基乙醇组最少,组间两两比较差异具有显著性意义(P<0.01);各组贴壁生长细胞中均未见CD34阳性细胞。④扩增培养4周后与黄芩苷组比较,空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低(P<0.01)。各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1%。结论:100μmol/L黄芩苷可促进脐血间充质干细胞体外扩增,且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强,同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化。

摘要：背景：课题组前期实验通过广泛筛选，发现中药单体黄芩苷在脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元定向诱导中效果良好，且其诱导效果明显优于其他单纯的抗氧化剂，可能有另外的机制在起作用。目的：探讨黄芩苷体外扩增人脐血间充质干细胞过程中核转录因子kB的激活及白细胞介素6浓度变化。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007—02／07在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成。材料：健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份，由南昌大学第一附属医院产科提供。所用黄芩苷相对分子质量为446．35，经高效液相色谱一荧光法测定纯度〉95％。抗氧化剂β-巯基乙醇为北方同正生物技术公司产品。方法：采用明胶沉降加密度梯度离心两步法分离脐血单个核细胞，调整细胞浓度为1．0×10^9L^-1接种，加入含体积分数为0．2胎牛血清、谷氨酰胺、B27、300ug／L粒巨噬细胞集落刺激因子、300ug／L干细胞因子的DMEM液体培养体系进行纯化和扩增培养。按照添加抗氧化剂的不同分为3组：空白对照组，不添加任何抗氧化剂；黄芩苷组向DMEM液体培养体系中加入100umol／L黄芩苷；β-巯基乙醇组向DMEM液体培养体系中加入3mmol／Lβ-巯基乙醇。主要观察指标：不同培养时间点脐血单个核细胞的扩增情况；用发绿色荧光信号的细胞核百分率代表核转录因子kB的激活率，间接免疫荧光染色检测脐血单个核细胞P65核移位细胞率；双抗夹心酶联免疫法测定贴壁细胞生长上清液中白细胞介素6的浓度。结果：培养第1周，β-巯基乙醇组与黄芩苷组脐血单个核细胞数量基本相似（P〉0．05），均明显高于空白对照组（P〈0．01）；培养第2-4周，脐血单个核细胞数量黄芩苷组〉β-巯基乙醇组〉空白对照组（P〈0．01）。培养3d及1～4周，空白对照组与β-巯基乙醇组的脐血单个核细胞P65核移位细胞率基本相似（P〉0．05），但均显著低于黄芩苷组（P〈0．01）。3组细胞培养上清液中白细胞介素6浓度的变化与脐血单个核细胞P65核移位细胞率基本。致。结论：黄芩苷能有效促进人脐血单个核细胞体外增殖，可能与其一定程度上激活即刻早期基因核转录因子kB，进而促使细胞提高分泌白细胞介素6水平有关。

摘要：背景:最近研究证实黄芩苷对多种脑损伤具有广泛的神经系统保护作用。目的:探讨中药单体黄芩苷干预并协同人脐血间充质干细胞静脉移植治疗幼鼠缺氧缺血性脑损伤的可行性。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-02/2008-01在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成。材料:健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份,取自南昌大学一附院产科。清洁级7d龄SD新生鼠85只,随机分为正常对照组15只、模型组20只、细胞移植组25只、细胞移植+黄芩苷组25只。方法:采用明胶沉降+密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,体外扩增至第5代用于移植,使用前6～12h行DAPI标记。模型组、细胞移植组、细胞移植+黄芩苷组新生鼠建立缺氧缺血性脑损伤模型,空白对照组不作任何处理。分别于造模后2,3,4,5周,细胞移植组、细胞移植+黄芩苷组经尾静脉注射DAPI标记好的人脐血间充质干细胞悬液5～10μL/g,细胞浓度为1×109L-1。从细胞移植第1天起,细胞移植+黄芩苷组动物经腹腔注射120mg/kg黄芩苷,1次/d,连续3d。主要观察指标:脑组织病变情况,脑组织DAPI阳性细胞数,脐血间充质干细胞移植后定位情况。结果:移植后4周,细胞移植+黄芩苷组脑组织病变率明显低于模型组、细胞移植组(P<0.05)。与细胞移植组比较,第1,2,4周细胞移植+黄芩苷组DAPI阳性细胞数均显著增加(P<0.01)。造模后第3周开始细胞移植的病灶脑组织,在黄芩苷的协同作用下可见大量DAPI阳性细胞集中分布于病灶区周围,与宿主脑整合,没有明显的界限,而对侧非缺血区很少见到DAPI阳性的脐血间充质干细胞分布;造模后第4,5周开始细胞移植的病灶脑组织,其DAPI阳性细胞明显减少。结论:选择缺氧缺血性脑损伤后第3周进行细胞移植效果较佳,黄芩苷能够协同人脐血间充质干细胞有效地透过血脑屏障,在病灶脑组织周围迁移、扩散、整合。