摘要：本研究旨在建立寨卡病毒（ZIKV virus,ZIKV）、登革病毒（Dengue virus,DENV）以及基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHIKV）三种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术。选用ZIKV的NS1基因、DENV的NS5蛋白基因以及CHIKV的E1蛋白基因作为靶标区域设计三组特异性引物探针,建立三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用ZIKV、DENV、CHIKV病毒体外转录RNA和病毒细胞培养物对该方法的灵敏性、特异性、重复性等方面进行评价,最后临床样本以及模拟标本验证。结果显示：三重实时荧光定量RT-PCR检测方法扩增效率均可达到90%以上,三种病毒体外转录RNA最低检测限均低于15拷贝/PCR,病毒培养物最低检出限均低于10PFU/mL且与单重检测方法无明显差异。与其他病毒无交叉反应,变异系数均在2%以内。临床标本及模拟标本检出率均可达95%以上。本研究建立的检测寨卡病毒、登革病毒以及基孔肯雅病毒的三重实时荧光RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于寨卡病毒病等相关临床标本的检测。

摘要：目的 初步建立白蛉病毒属Luminex多重液相芯片核酸检测方法.方法 设计立夫特谷热病毒（RVFV）、发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）和哈特兰德病毒（HLV）特异性引物和探针,采用靶序列富集多重PCR技术（Tem-PCR）对其靶序列进行扩增,并建立Luminex多重液相芯片核酸检测方法.利用RVFV、SFTSV和HLV靶序列Tem-PCR产物,以及汉滩病毒（HTNV）等7种出血热病毒核酸扩增产物评价其特异性,利用体外转录病毒RNA参考品评价其敏感性和稳定性.结果 建立的白蛉病毒属病毒Luminex多重液相芯片核酸检测方法可特异性检测RVFV、SFTSV和HLV靶序列,且与HTNV等7种出血热病毒无交叉反应.对体外转录获得的RVFV、SFTSV和HLV的RNA参考品,可分别检出10^3拷贝/μl、10^2拷贝/μl和10^2拷贝/μl.10^3拷贝/μl以上各浓度RNA参考品检测值的组内和组间变异系数均小于15％.结论 初步建立了白蛉病毒属Luminex多重液相芯片核酸检测方法,可有效检测RVFV、SFTSV和HLV,为相关传染病的实验室诊断奠定了基础.

摘要：目的建立非洲地区较为高发的7种重要病毒病基于荧光微球的多重核酸检测方法完成初步的评价分析。方法比较分析引起裂谷热、黄热，马尔堡，埃博拉、拉沙热、克里米亚-刚果出血热和基孔肯雅热等病原体的基因组序列，结合前期实时荧光PCR检测方法，设计合成特异性多重扩增引物和杂交探针，建立基于荧光微球的核酸检测方法，采用化学合成DNA和体外转录RNA等方法制备相关病原体模拟样本和参考品，评价检测方法的灵敏度和稳定性，利用30份登革热、汉城出血热等疑似患者标本和32份正常人血标本评价特异性。结果所建立的基于荧光微球的针对7种非洲多发病毒病核酸检测方法可特异性检出相应病原体核酸，检测限可达102～105拷贝/ μl，特异性为100%，组内变异系数均在12%以下，组间变异系数在15%以下，具有较高的稳定性。结论初步建立了基于荧光微球的7种非洲多发病毒病核酸检测方法，为相关疑似传染病筛查提供了新的选择。

摘要：目的结合微流控与荧光定量RT-PCR技术建立寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、黄热病毒(yellow fever virus,YFV)和基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)的快速核酸检测方法,以实现这4种病毒感染的快速诊断。方法以ZIKV的NS1基因、DENV和YFV的NS5基因以及CHIKV的E1基因作为靶序列设计4组特异性引物探针;用体外转录RNA评价方法的灵敏性;用其他病毒核酸评价方法的特异性;ZIKV、YFV、CHIKV检测方法采用模拟阳性样本,DENV检测方法采用临床患者标本进行验证,并与传统荧光定量RT-PCR检测方法进行比较。结果ZIKV、DENV、YFV、CHIKV4种方法的最低检出限分别是14.57拷贝/μl、94.27拷贝/μl、8.25拷贝/μl、223.19拷贝/μl;4种检测方法与其他病毒核酸无交叉反应;ZIKV、YFV、CHIKV模拟阳性样本检出率为100%,各浓度检测Ct值的变异系数均在2%左右;20份DENV临床患者标本检出率为100%,与传统荧光定量RT-PCR检测方法结果一致。结论本研究建立的ZIKV、DENV、YFV、CHIKV微流控荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性、稳定性,25 min内即可完成1次检测,可适用于现场实验室检测与早期诊断。

摘要：2015年以来,寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)感染被报告和小头症之间存有关联,已有多个国家和地区报告ZIKV感染证据,我国持续面对ZIKV输入风险。为发展适用于现场的快速高效的ZIKV核酸检测方法,选取ZIKV NS1片段保守区设计特异性引物探针,经优化建立了多种功能蛋白介导的ZIKV RNA恒温快速扩增检测方法。利用所制备的ZIKV NS1片段体外转录RNA作为参考品,并与实时荧光定量RT-PCR检测结果进行比较。同时利用ZIKV细胞培养物中加入健康人血清制备的模拟临床标本进行初步验证。结果显示,建立的RNA恒温快速扩增检测方法可100%检出100拷贝/μL体外转录RNA,可在15 min以内判读,大大低于PCR的常规检测时间;用该方法检测其他相关病毒,无交叉反应。病毒滴度在(104~107 PFU/mL)之间的模拟临床病人标本可达到100%检出。本研究建立的ZIKV RNA恒温扩增快速检测方法快速、灵敏、特异,适用于ZIKV现场应急检测,为ZIKV的防控提供了重要的技术支撑。

摘要：建立可检测琉球病毒(Ryukyu virus,RYKV),索尔韦齐病毒(Solwezi virus,SOLV)以及苏里斯病毒(Souris virus,SOUV)等三种沙粒病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法。分析三种病毒流行病学分布特征,从国际公共数据库搜索下载基因组序列,进行比对分析,确定检测靶标,借助primer premier 6.0生物信息学软件,设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,利用化学合成和体外转录方法制备模拟样本,比较评价三种方法的检测限、特异性、重复性特征。所建实时荧光定量RT-PCR检测方法均可有效扩增检测病毒RNA靶标,检测限分别为40拷贝/μL、7拷贝/μL和15拷贝/μL,检测汉城病毒、汉滩病毒、登革病毒Ⅰ~Ⅳ型分离株、发热伴血小板减少综合病毒及30份健康人血清样本无非特异性扩增,三种病毒相互间以及其他8种出血热相关沙粒病毒RNA间无交叉反应,重复性比较分析显示变异系数均在2%以内。本研究建立的检测RYKV、SOLV和SOUV三种沙粒病毒的实时荧光RT-PCR方法具备用于相关疑似感染者临床样本、宿主动物标本以及进出口物品的筛查检测的潜力,但因未经基于实际病毒感染样本的比较评价,检测结果的解释仍具有一定的局限性。

摘要：目的 探索实验室高通量检测前临床样本中病毒核酸特异性纯化富集的方法.方法 以负链RNA病毒发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）为模拟样本,针对病毒基因组S、M和L三个片段设计杂交探针,并进行5＇端生物素修饰,与链霉亲和素修饰磁珠共价结合,纯化样本中SFTSV核酸,比较研究特异性纯化富集对样本二代测序效果的影响.结果 cDNA文库制备时全转录组扩增前或后进行特异性富集纯化均较不开展富集纯化有显著改善,有效数据比例分别为5.57％、6.39％、2.71％,差别具有显著性（x2=9 799.8,P＜0.001）.对全转录组扩增前或后进行特异性富集纯化对测序结果进行比较分析时发现,扩增后进行纯化优于扩增前（P＜0.001）.结论 基于核酸杂交的病毒基因组特异性富集纯化方法可有效降低二代测序中背景值,提高测序效率,具有高通量检测前特异性纯化富集样本的作用.

摘要：侧柏是一种常见的荒山造林树种,有着耐干旱贫瘠、耐盐碱等能力,在西北地区的种植培育较为常见。以甘肃陇西地区为例,考虑到其特殊性,在侧柏良种培育过程中会有较大的难度,尤其是在旱地侧柏良种培育中所遇到的困难会更多,如何结合实际情况来做好柏良种培育尤为关键,非常值得深入探究。基于此,文章重点分析论述甘肃陇西地区的侧柏良种培育要点及策略,包括苗地选择、育苗途径、种子处理和播种、苗期管理等。

摘要：目的建立可以检测阿瓦朗病毒(Avalon virus,AVAV)和休斯病毒(Hughes virus,HUGV)两种内罗病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并进行初步的评价。方法收集、整理、比对、分析在公共数据库发布的两种病毒基因组核苷酸序列,确定检测靶标,设计特异性引物、探针,优化检测程序,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法。利用体外转录技术制备的模拟样本、其他病毒感染标本、病毒株和正常人血标本比较评价所建方法的检测限、特异性、重复性特征。结果所建实时荧光定量RT-PCR检测方法可有效扩增检测AVAV和HUGA靶标RNA,检测限分别约为20拷贝/μl和70拷贝/μl,检测科萨努尔森林病毒、乙型流感病毒BV和BY型、甲型流感病毒H3N2、黄热病毒、乙型脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、发热伴血小板减少综合征、内罗毕羊病毒和塔西那病毒样本无非特异性扩增,两种内罗病毒相互间无交叉反应,重复性比较分析显示变异系数小于2%。结论本研究建立的检测AVAV和HUGV的实时荧光定量RT-PCR方法,可用于临床样本检测和媒介生物、宿主动物标本筛查,便于病原的快速识别和疾病诊断。

摘要：目的 建立一种可以同时鉴别寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的检测方法。方法 通过全球共享数据库中检索下载寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒全基因组序列进行比对分析,估计其保守区,确定靶基因位置,针对这3种病毒分别设计特异性引物和探针,建立三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对方法的特异性、灵敏性和重复性进行评估。结果 所建立实时荧光定量RT-PCR检测方法可检出寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒模拟样本,最低检出限分别为寨卡病16.22拷贝/PCR,基孔肯雅病毒12.02拷贝/PCR,马雅罗病毒体外转录RNA为2.82拷贝/PCR,三重组合检测与3种病毒分别单重检测,灵敏度无明显差别。与登革病毒、汉坦病毒、SFTS病毒、黄热病毒和流感病毒等无交叉反应,检测100份健康人体检血清样本未见非特异性反应,特异性为100%。重复性结果显示,通过选取高、中、低3个不同浓度梯度的病毒核酸或体外转录RNA,3种病毒的标准差均控制在0.5以内,变异系数在2%以下。结论 建立了寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,该方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。