摘要：本研究依据赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)RNA2的序列,在其3′端设计反转录引物,在5′端设计PCR扩增引物,构建了一种可以评价RNA链相对完整性的RT-PCR方法,命名为LR RT-PCR(Left reverse transcript Right amplify RT-PCR),并对该方法的引物浓度、Mg2+浓度、d NTPs浓度、退火温度4个重要参数进行了优化。结果显示,优化后的LR RT-PCR反应体系为:引物浓度0.2μmol/L、Mg2+浓度4 mmol/L、d NTPs浓度0.5 nmol、退火温度60℃。本研究建立的LR RT-PCR方法灵敏度高,可以检出1 pg的RGNNV RNA2标准品;该方法特异性强,与RSIV等鱼类常见病毒、鳗弧菌等常见水产病原菌以及石斑鱼RNA均不产生交叉反应。应用建立的LR RT-PCR方法对臭氧破坏RGNNV RNA2的效果进行评价,发现当臭氧浓度由0.3 mg/L依次增加为0.5、1.0、2.0 mg/L时,LR RT-PCR的扩增产物逐渐减少,直至消失。结果表明,建立的LR RT-PCR方法可以快速、准确地评价臭氧对RGNNV RNA2的破坏效果,适用于养殖场评估臭氧对RGNNV的消毒效果,并对RGNNV进行检测和监控。

摘要：淋巴囊肿病毒(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原,危害巨大。为实现这7种病原的高通量、同步检测,本研究在分析这7种病毒基因序列的基础上,设计了9组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)引物,并对扩增体系中的Taq酶、M^g(2+)、d NTP、Primer Mix浓度及退火温度等参数进行调整和优化,结合基因芯片检测技术,建立了同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR体系为:Taq酶(2.5 U/μl)1.0μl,10×PCR Buffer(含20 mmol/L的M^g(2+))5μl,d NTP(各2.5 mmol/L)5μl,10×Primer Mix(各2μmol/L)9μl,模板1μl,dd H2O补足至50μl,退火温度为56℃。研究结果显示,该方法可以在1支反应管内对上述7种病毒的9个致病基因同步进行扩增和检测,检测灵敏度分别为10~1copies/μl(RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、10~2 copies/μl(LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和10~3 copies/μl(大菱鲆红体病虹彩病毒,TRBIV)。该方法特异性强,与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法具有高通量、高灵敏度、高准确性的优势,能有效提高工作效率,在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。

摘要：为了快速检测鱼类神经坏死病毒,本研究设计了病毒特异性的发夹型探针,经硫醇修饰后与纳米银溶胶结合,制备了鱼类神经坏死病毒纳米探针(Ag-NNV),并使用透射电镜、多功能酶标仪、表面增强拉曼光谱仪等对纳米探针Ag-NNV的表征及发夹型探针在纳米银粒子表面的覆盖率进行了测定和分析。结果表明,裸露的纳米银粒子为球形,平均直径50 nm;制备的纳米探针颗粒为球形,平均直径90 nm。纳米银粒子和纳米探针在溶液中均具有良好的分散性。平均每个纳米银粒子表面结合发夹型探针约100条,单位表面积的探针覆盖量为0.56 pmol/cm2。该纳米探针制备简便,适合用于表面增强拉曼散射法对鱼类神经坏死病毒进行快速检测。