摘要：为探究衬砌管片的混凝土开裂破坏,考虑加入碳纤维来改善其力学性能。设计了不同配合比的碳纤维混凝土试件,进行了碳纤维长度和掺量对碳纤维混凝土的抗压强度、劈裂抗拉强度的研究。试验结果表明:碳纤维混凝土较普通混凝土抗拉和抗压强度均得到了增强,其中抗拉强度增加程度最大,达到普通混凝土的150%,弹性模量和延性也均得到了提高,利用这些特征可以有效延缓和阻止衬砌管片开裂。此外,通过试验数据拟合得到了碳纤维混凝土应力-应变曲线表达式,为碳纤维混凝土在数值模拟中奠定理论基础。

摘要：试验旨在利用CRISPR/Cas9技术分别在鸡成纤维细胞DF-1和鸡胚胎干细胞(Em-bryomic stem cell,ESCs)上介导CPED1基因敲除,以期为后续研究CPED1基因功能提供技术依据。克隆CPED1基因全长;构建cas9/g RNA载体并转染DF-1和ESCs,经流式分选阳性细胞,采用T7E1酶切法选择活性最佳的敲除载体并分析其敲除效率;同时,对DF-1中的脱靶效率进行检测。结果成功克隆鸡CPED1基因,并构建3个cas9/g RNA载体;T7E1酶切结果表明cas9/g RNA1载体在DF-1阳性细胞中的敲除活性(37%)最佳,该载体也可定点敲除ESCs中的CPED1基因,敲除活性为25%,且在DF-1细胞中未发生脱靶。表明CRISPR/Cas9可有效介导鸡CPED1基因在DF-1和ESCs上敲除。

摘要：为克隆如皋黄鸡Stra8基因的3’UTR,寻找靶向Stra8基因的microRNA(miRNA),以鸡精原干细胞的c DNA为模板,根据NCBI数据库Stra8的CDS序列设计引物,通过3’RACE技术克隆Stra8基因的3’UTR,并构建相应的荧光素酶表达载体和突变载体;利用生物学预测软件对靶向Stra8 3’UTR的miRNA进行预测,选择评分最高的miRNA进行慢病毒载体构建;以pRL-TK为内参,分别将miRNA与Stra8 3’UTR荧光素酶表达载体和突变载体共转染DF-1细胞,利用双荧光素酶基因报告系统对miRNA进行活性检测。结果表明,采用3’RACE技术成功克隆Stra8基因的3’UTR;Targetscan生物在线软件预测到靶向Stra8基因的4个特异性较高的miRNA,并成功构建其相应的慢病毒载体;双荧光素酶活性检测结果显示,gga-miR-1a、gga-miR-31、ggamiR-218均可通过3’UTR序列抑制Stra8基因的表达,其中gga-miR-31抑制效果最佳。该结果可为后续深入探讨gga-miR-31介导调控的Stra8基因在雄性生殖细胞分化中的调控网络提供依据。

摘要：本研究旨在通过悬浮培养法培养鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs),摸索鸡胚胎干细胞形成类胚体(Embryoid body,EB)的最佳方案,以期提高鸡胚胎干细胞体外诱导效率。将鸡ESCs培养传代至第3代,采用1×104、3×104和6×104 mL-13个细胞浓度,使用悬滴培养后,观察类胚体的形成效率。对悬滴培养形成的类胚体进行形态学观察,qRT-PCR检测干细胞标记基因的表达,免疫细胞化学检测相关蛋白的表达,并进行类胚体自分化检测和核型分析。3×104 mL-1细胞浓度生成的类胚体数量最高,单个视野下可观察到约267个类胚体,且形成的类胚体大小均一,呈圆球状。qRT-PCR检测结果表明,在类胚体形成48h内,干细胞标记基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit仍维持表达。免疫细胞化学检测显示,该方法形成的类胚体表面抗原检测Nanog和SSEA-1呈阳性。自分化检测三胚层分化标记基因SOX17、SMA和TUJ-1呈阳性。核型分析显示,悬滴培养形成的类胚体具有并保持正常的核型。鸡ESCs悬滴培养形成类胚体的适宜细胞浓度为3×104 mL-1,且形成的类胚体可分化成3个胚层,用于体外定向诱导过程。本研究建立了鸡ESCs体外悬滴培养形成类胚体的培养体系,为后期信号通路的体外验证提供试验基础。

摘要：本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据。基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP(chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率。Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%。通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除。

摘要：克隆如皋黄鸡LBC(Libichun)基因CDS区,通过GFP-LBC融合蛋白和间接免疫荧光法(IFA)来实现该基因的亚细胞定位,为其基因功能研究奠定基础。提取如皋黄鸡18日龄的鸡胚睾丸RNA,巢式PCR方法扩增LBC基因的CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N1-LBC转染DF-1细胞,48h后观察其绿色荧光表达情况,同时制备LBC基因的多克隆抗体,利用IFA标记LBC基因的表达部位。本研究成功克隆出如皋黄鸡LBC基因的完整编码区,成功制备抗体和构建pEGFP-N1-LBC、pcDNA3.0-LBC。GFP-LBC融合蛋白和IFA的结果显示,如皋黄鸡LBC基因在细胞质和细胞核中都有表达,为下一步LBC基因的功能研究奠定了基础。

摘要：旨在确定小鼠DAZL启动子基本活性区,并分析启动子区域甲基化对其启动子活性的影响,探究小鼠DAZL的表达调控机制。采用PCR法扩增不同长度的小鼠DAZL启动子,插入到p EGFP-N1和p GL3-Basic载体,构建重组载体。将重组载体转染GC-1细胞系,并通过添加适量DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azacytidine,5-aza-C)逆转各试验组启动子片段的甲基化水平,然后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测DAZL活性变化。双荧光素酶活性检测结果表明,小鼠Dazl启动子基本活性区域为5’侧翼区-370^-36 bp,在-370^-166 bp区域存在不可或缺的重要调控元件;经5-aza-C处理后,各缺失片段载体转染的GC-1细胞DAZL的启动子活性与对照组相比均有不同程度的提升,但差异不显著。本试验确定了小鼠DAZL启动子基本活性区域,证明降低小鼠睾丸DAZL启动子区域甲基化水平,有助于DAZL在生殖细胞中特异性表达,为进一步探究DAZL生物学功能和调控机制提供参考。