摘要：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)是栖息于牛呼吸道的2种常见细菌,可引发牛的呼吸道疾病,对养殖业产生一定经济损失。为提高这2种细菌所导致疾病的临床诊断效率,本研究根据Pm的Kmt1基因、Mh的Lkt基因序列分别设计了特异性引物,建立了一种同时检测2种细菌的双重PCR检测方法。结果显示,建立的双重PCR方法对其他牛源细菌及病毒检测结果均为阴性,Pm、Mh病原基因组DNA的检测下限分别为1.57×10~5,1.98×10~6 copies/μL,表明该方法具有较好的特异性和敏感性。应用此双重PCR方法对宁夏地区118份临床样品进行了检测,结果显示Pm的检出率为57.63%(68/118),Mh的检出率为30.51%(36/118),混合感染检出率为24.58%(29/118),而且双重PCR检测结果与单一PCR检测结果一致,表明该方法可用于临床检测。Pm和Mh 2种病原双重PCR检测方法的建立,为牛呼吸道疾病的临床诊断提供了一种方便、快捷和准确的检测手段,具有一定的临床应用价值。

摘要：为建立同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)这5种牛呼吸道病毒的方法,根据BVDV的5′UTR、IBRV的gB基因、BRSV的N基因、BCoV的N基因、BPIV3的HN基因序列设计特异性引物,建立了一种多重PCR检测方法。结果显示,该方法对其他牛源病毒及细菌无特异性扩增,对BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3的最低检测限分别为10^(3),10^(3),10^(4),10^(3),10^(4)拷贝/μL。对采集自宁夏地区186份鼻拭子样本的检测结果显示,BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3阳性检出率分别为8.06%(15/186),10.75%(20/186),15.05%(28/186),16.67%(31/186),7.53%(14/186),与单重PCR检测结果一致。结果表明,本试验建立的多重PCR检测方法可用于牛呼吸道病毒的检测及流行病学调查。

摘要：旨在建立一种高效、快速、准确的检测产气荚膜梭菌并分型的多重PCR方法。根据GenBank上公布的产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素的基因序列,设计、合成4对针对4种毒素的特异性引物。并通过改变引物浓度、退火温度等反应条件,对多重PCR方法进行优化。结果显示,对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素基因均扩增出了预期大小的目的条带,而金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、停乳链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌均未出现条带;当核酸质量浓度降至12.5μg/L时,仍可清晰地扩增出α、β、ε、ι毒素基因对应条带。在核酸质量浓度降至3.12μg/L时,仍可观察到α与ε毒素基因扩增出的条带。在核酸质量浓度降至0.78μg/L时,α毒素基因对应的条带仍可隐约可见。应用该方法对68份疑似产气荚膜梭菌导致猝死的牛鼻拭子样进行检测,其中有52份样品检测结果显示为C型产气荚膜梭菌,剩余16份样品均为非产气荚膜梭菌,阳性率为76%。结果表明,本研究建立的多重PCR方法特异性强、灵敏度高重复性好,可准确地鉴别区分5种类型的产气荚膜梭菌。在采样时仅需采取疑似病畜的鼻拭子,操作简便、快捷、安全。对临床检测病畜的产气荚膜梭菌病有较为重要的意义。

摘要：旨在研究电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel1,VDAC1)对卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的调控作用及其机制。设计并合成VDAC1的小干扰RNA(si-VDAC1)转染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,再用BCG感染。后续采用MTT法检测RAW264.7细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率、线粒体膜电位及细胞内ROS水平,进而通过实时荧光定量PCR和Western blot检测凋亡相关因子Cyt C、Caspase-3、PARP1、Caspase-9基因(mRNA)及其蛋白的表达。随后,通过使用VDAC1寡聚抑制剂VBIT-4对RAW264.7进行孵育2 h后感染BCG,并采用免疫荧光染色技术观察Caspase-3和Western blot检测凋亡相关因子Cyt C、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP1、Cleaved-Caspase 9的含量变化。BCG感染巨噬细胞12 h后,与对照相比,BCG感染后小鼠巨噬细胞存活率约下降至50%,而凋亡率显著上调到52.12%(P<0.001),线粒体膜电位降低(P<0.001),细胞内ROS水平升高(P<0.001),并且凋亡关键调控因子Cyt C、Caspase-3、PARP1、Caspase-9的mRNA及蛋白表达水平显著上调(P<0.001);当用si-VDAC1和BCG共同处理小鼠巨噬细胞时,细胞存活率、细胞凋亡率、线粒体膜电位水平、细胞内ROS水平及凋亡关键调控因子均显著得到了恢复(P<0.001);使用VDAC1寡聚抑制剂VBIT-4处理后同BCG处理组相比,VBIT-4显著抑制了VDAC1寡聚体的形成和凋亡相关因子Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP1、Cleaved-Caspase 9剪切体的含量(P<0.001)。结果表明,VDAC1可通过寡聚形成大的通道影响线粒体外膜通透性,通过Cyt C等凋亡蛋白释放的途径参与调控BCG感染RAW264.7诱导的细胞凋亡。

摘要：为了同时检测奶牛乳房炎中的6种主要致病菌,本试验分别针对金黄色葡萄球菌的nuc基因、无乳链球菌的ef-tu基因、绿脓杆菌的eta基因、停乳链球菌的16srRNA基因、致病性大肠杆菌的Phoa基因、牛支原体的opp D/F基因设计合成了6对特异性引物。在建立并验证单一PCR的基础上,构建多重PCR反应体系,对其反应体系进行优化,验证了该方法的特异性和敏感性。结果表明,该6重PCR检测方法对奶牛乳房炎的其他病原菌没有特异性扩增,对牛支原体、致病性大肠杆菌、停乳链球菌、绿脓杆菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌最低检出终浓度分别为1.1×10^(5)、1.41×10^(6)、1.6×10^(3)、3×10^(5)、3.8×10^(4)和7.3×10^(3)拷贝/μL。对采集的宁夏地区98份临床乳房炎病例乳样的检测结果显示:牛支原体、致病性大肠杆菌、停乳链球菌、绿脓杆菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌的检出率分别为10.2%(10/98)、14.2%(14/98)、14.2%(14/98)、12.2%(12/98)、18.3%(18/98)、18.3%(18/98)。本研究建立的多重PCR检测方法具有良好的特异性及敏感性,可用于奶牛乳房炎6种主要致病菌的检测及流行病学调查。