摘要：目的建立柯萨奇病毒A组5型(CVA5)特异的一步法实时荧光反转录聚合酶链反应(RT-PCR)核酸检测方法。方法以流行于遵义地区的CVA5病毒株和NCBI基因库中随机下载的CVA5 VP1基因序列作为参考序列,分析这些序列的保守区域,在其保守区设计特异性的引物与Taqman探针,建立检测CVA5的一步法实时荧光RT-PCR。通过构建含CVA5 VP1保守区域的重组质粒,绘制标准曲线,并对检测方法的灵敏度、特异性、重复性及临床样本检出限进行评价。利用该方法对遵义地区273份未明确分型的肠道病毒阳性样本进行检测,将检出的部分CVA5阳性产物进行测序。结果成功建立一种基于实时荧光RT-PCR的CVA5检测方法,该方法在10^(4)~10^(9)copy/mL范围内具有良好的线性关系(R 2>0.999),平均扩增效率为102.26%。灵敏度高,对临床样本的检出限为103copy/mL。该方法的特异性强,与柯萨奇病毒A组2型(CVA2)、柯萨奇病毒A组4型(CVA4)、柯萨奇病毒A组6型(CVA6)、丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒和鼻病毒等均不发生交叉反应。重复性实验的变异系数低于1.5%。273份未明确分型肠道病毒阳性样本中共检出25份CVA5,占未明确分型阳性样本的9.16%。结论该研究建立的一步法CVA5RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于CVA5的检测。