摘要：为建立一种简单、快捷,适用于基层检测猪丁型冠状病毒(PDCo V)的方法,根据Gen Bank上登录的PDCo V N基因的保守序列设计了1组环介导等温扩增(LAMP)引物,以重组质粒p MD19-T-N为模板、羟基萘酚蓝为显色剂,优化反应条件及体系,并检测该方法的特异性及灵敏度。结果显示,该方法与猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应,且最低检测量为5.1×10^(1)copies/μL。进一步对本实验室2016年至2019年在河北保定收集的95份临床样品进行检测,LAMP检测结果与普通RT-PCR检测结果的符合度高,检测时间为1 h。结果表明,本研究中建立的LAMP检测方法简便、特异、灵敏、快速,有望在PDCo V的临床检测中发挥重要作用。

摘要：猪丁型冠状病毒(PDCoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)均为致病性冠状病毒,可以引起猪呕吐、腹泻脱水和新生仔猪死亡。为了建立一种快速检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank登录的2种病毒基因的保守序列,设计了两对特异性引物,分别扩增其N、M基因保守区,并将其克隆至pMD19-T载体;将10倍梯度稀释的混合重组质粒作为标准品模板,建立了一种检测PDCoV和PEDV的双重的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,并对其反应的敏感度、特异性和重复性进行了检测。结果表明,本试验所建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法对PDCoV和PEDV的最低检测量分别为51和32拷贝·μL-1,且与PBoV、TGEV、PRV、PCV2无交叉反应,特异性较好;对2016年至2017年在河北省收集的130份仔猪腹泻样本检测,结果显示,PDCoV的检出率为16.9%,PEDV的检出率为66.2%,二者同时感染的检出率为2.3%,与普通RT-PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为PDCoV和PEDV的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。

摘要：副猪嗜血杆菌（***）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒（PRRSV）是引起猪呼吸系统疫病的3种重要病原，根据GenBank中这3种病原的基因组序列，选择基因序列的高保守区，分别设计合成了3对特异性引物进行3种病原的多重PCR，并对反应条件进行优化。利用建立的多重PCR方法，对河北省2012-2013年发生呼吸系统疾病的412份猪病料进行检测，并随机选择其中的57份，同时进行单一PCR检测，以确定2种方法检测结果的符合程度。结果表明，3对引物能特异扩增出大小分别为469，829，219bp的目的条带。灵敏度检测试验表明，***，PCV2和PRRSV的最低检测量分别为52．7，335．0，137．0Pg。412份临床样品检测结果显示，***在2012年的阳性率为44．2％，2013年为45．1％，提示这2年引起猪呼吸道疫病的主要病原是***。

摘要：由猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的繁殖障碍性疫病在中国的不断暴发,增加了猪的发病率和死亡率。为了建立同时检测这3种病毒的多重PCR方法,本研究根据GenBank中这3种病毒的参考基因序列设计引物,并对反应中的影响因素进行优化,建立了同时检测CSFV、PRV和PRRSV的多重PCR方法。该方法扩增的基因片段大小分别为570(CSFV),232 (PRRSV)和173bp(PRV)。敏感性和特异性试验结果显示,该方法对3种病毒的核酸最低检出量分别为23.88(CSFV),13.10(PRRSV)和14.60pg(PRV),对大肠杆菌(***)、沙门菌(Salmonella)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。对2015年5月至2016年1月收集的168份临床样本检测结果显示,CSFV阳性率为24.4%,PRRSV阳性率为21.4%,提示河北省该段时间内引起猪繁殖障碍性疫病的主要病原为CSFV和PRRSV。经多重PCR检测为PRRSV、PRV或CSFV阳性的临床样本,再次使用商品化的试剂盒进行检测,符合率为100.0%。这些结果表明,本试验建立的多重PCR方法省时、高效,可用于PRRSV、PRV和CSFV感染的临床诊断。