摘要：本研究设计了一对特异性引物NSM1/NSM2,对三株广西狂犬病病毒NS和M基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序.同源性分析表明,三株广西野毒NS基因核苷酸同源性为87.2%～98.4%,M基因核苷酸同源性为90.1%～99.7%;与固定毒和狂犬病相关病毒比较,NS基因分别为79.9%～82.8%和69.7%～71.0%;M基因的分别为82.8%～87.8%和75.0%～77.8%.三株野毒NS基因氨基酸同源性为93.3%～98.7%,M基因氨基酸同源性分别为97.5%～100%.表明广西各地毒株之间亲缘关系不同,但最为相近;与狂犬病固定毒株亲缘关系较远;与狂犬病相关病毒亲缘关系最远.

摘要：狂犬病病毒为不分节段单链负股的RNA病毒,属弹状病毒科狂犬病病毒属。世界上几乎所有国家都有狂犬病发生,狂犬病病毒能够使所有温血动物发病致死,死亡率高达100%。本研究根据GenBank中的狂犬病病毒M基因序列,选择保守区域设计引物,通过对SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。结果显示,建立的狂犬病病毒实时荧光定量PCR方法,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,是开展狂犬病的临床检测的有力工具。

摘要：根据VR2332和CH-1aE基因序列设计一对特异性引物,对广西、广东、海南三省15个猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株E基因进行RT-PCR扩增,将扩增出的668bp片段插入pMD18-T载体中,进行序列测定。结果显示,15个毒株的E基因核苷酸序列之间的相似性为84.1%～100%,推导编码的氨基酸序列之间的相似性为81.1%～100%;与VR2332、CH-1a、LV株核苷酸之间的相似性分别为85.4%～98.5%、87.1%～96.2%、62.5%～63.8%,与VR2332、CH-1a、LV株氨基酸之间的相似性分别为83.1%～95.5%、86.1%～95.0%、51.7%～57.2%,表明15个毒株的E基因区域变异较大,均属美洲型。将15个流行毒株与国内外已发表的37株猪繁殖与呼吸综合征病毒相应序列进行比较,建立的遗传进化树表明这15个毒株分别属于3个亚群。推导编码氨基酸的比较结果表明,分别属于不同亚群的不同地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株在E基因编码蛋白的潜在糖基化位点数目、抗原表位区域和与毒力相关的氨基酸等均存在变异。

摘要：流感病毒给全球公共卫生带来了严重威胁,疫苗接种是预防流感及严重并发症的有效手段。本研究分析了北半球2012–2022年间人类甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)流行株血凝素(hemagglutinin,HA)中HA1亚基的氨基酸突变趋势和抗原显性位点变化情况。基于世界卫生组织(World Health Organization,WHO)公布的2022年北半球流感疫苗推荐株A/Wisconsin/588/2019(H1N1)和A/Darwin/6/2021(H3N2)的HA1氨基酸序列,通过马赛克(mosaic)遗传算法设计了3种Mosaic-HA1抗原并将其在293F细胞中进行表达、纯化。将纯化后的Mosaic-HA1抗原与明矾佐剂以1:1的体积比混合制备亚单位疫苗并免疫BALB/c小鼠以评价免疫效果。酶联免疫吸附实验表明Mosaic-HA1抗原能产生同时结合两种亚型HA1的IgG,其中结合H3蛋白、H1蛋白的特异性效价IgG效价分别达到10~5、10~3以上,攻毒实验表明Mosaic-HA1能抵抗H3N2和H1N1流行毒株的攻击。本研究通过对不同亚型IAV毒株HA1中免疫显性位点进行重新组合,为多价亚单位流感疫苗开发提供了新思路。

摘要：【目的】克隆猪源异质性核糖核蛋白A1(hnRNPA1)基因编码区(CDS)序列并构建其真核表达载体,为探究猪源hnRNPA1蛋白结构及其生物学特性提供理论参考。【方法】利用总RNA提取试剂盒提取PK-15细胞总RNA并反转录合成cDNA,以此为模板,采用SnapeGene设计hnRNPA1基因特异性扩增引物,PCR扩增获得hnRNPA1基因CDS序列。通过ProtParam、ExPASy-ProtScale、TMHMM-1.0、SignalP-6.0、SPOMA、SWISS-MODEL和NetPhos 3.1等预测hnRNPA1蛋白的理化性质、结构及磷酸化位点。构建pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达载体并转染HEK-293T细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blottiing和免疫荧光染色试验检测hnRNPA1基因真核表达载体构建情况、hnRNPA1蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。生物信息学分析结果显示,hnRNPA1基因CDS序列全长963 bp,编码320个氨基酸残基,hnRNPA1蛋白分子量约为35 kD,理论等电点(pI)为9.27,脂肪系数为38.34,不稳定系数为43.87(大于40.00),蛋白结构相对不稳定,总平均亲水性指数(GRAVY)为-0.879,属于亲水性蛋白,不含跨膜结构域和信号肽,二级结构由α-螺旋(16.56%)、无规则卷曲(72.50%)和延伸链(10.94%)组成,存在48个潜在的磷酸化位点。Western blotting检测结果显示,真核表达载体pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag转染HEK-293T细胞后能成功表达hnRNPA1蛋白。免疫荧光染色结果显示,hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达。【结论】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。猪源hnRNPA1蛋白为不稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域和信号肽,二级结构主要为无规则卷曲。成功构建pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达载体,hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达。

摘要：参考已发表的猪瘟病毒 (CSFV) Shimen株、HCL V株、Paderborn株的核苷酸序列 ,设计并合成 1 1对引物 ,应用RT- PCR技术 ,成功地分 1 1个片段扩增了 CSFV广西流行毒株 GXWZ0 2的全基因组。将这 1 1个基因片段克隆 ,并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件 Vector NTI将 1 1个基因片段进行拼接 ,确认 CSFV GXWZ0 2株全基因组序列的长度为 1 2 2 96个核苷酸 (Gen Bank收录号 AY3 6 776 7)。将 GXWZ0 2株与国内外已发表的 Shimen、HCL V、3 9、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort1 87、Paderborn、CS、AL D、GPE- 、P97、L PC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较 ,核苷酸同源性分别为 85 .4 %、 84 .6 %、88.7%、85 .7%、 85 .7%、 85 .3 %、85 .6 %、 95 .3 %、 85 .7%、85 .7%85 .4 %、83 .4 %、84 .3 % ,推定的氨基酸同源性分别为 92 .6 %、91 .7%、94 .2 %、 93 .1 %、92 .9%、92 .3 %、 93 .0 %、97.7%、92 .6 %、93 .0 %、92 .6 %、90 .5 %、90 .6 %。 GXWZ0 2与 Shimen、HCL V的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异 ,表明 GXWZ0 2株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析 ,所比较的 1 4株 CSFV被分为2个群 :GXWZ0 2、Paderborn和 3 9这 3个毒株被归为群 .

摘要：为了解牛乳头瘤病毒1型(bovine papillomavirus genotype 1,BPV-1)广西GX01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,同时了解该毒株引起宿主产生的病理组织学变化情况,本研究选取广西贺州市患病牛皮肤肿瘤样物制作石蜡切片后镜检观察,提取病料DNA,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR扩增以确定此病毒的基因型,根据GenBank中BPV参考株设计嵌套引物,对GX01株进行全基因组扩增、克隆测序及序列分析。病理组织学检查结果显示,可在病变部位发现表皮细胞增生、肿胀,角质过度及挖空细胞等乳头瘤病毒感染的特征性病变。序列分析结果表明,GX01株为BPV-1,其全基因组长为7 945bp,包含E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、L2 8个开放阅读框,符合BPV-1型基因组的结构特征;GX01与BPV-1参考株全基因组核苷酸序列同源性为98.6%~99.6%,与BPV-2型参考株(M20219.1)、BPV-13型参考株(JQ798171.1)同源性分别为86.9%和87.2%。GX01株为广西地区首次经检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。本研究为广西地区乃至全国的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律、遗传变异、疫源追溯及科学防控提供了基础数据。

摘要：近来,广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊、仔猪呼吸道症状等为特征的流行性传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染所致。本研究从病猪中采集材料,经RT-PCR检测为阳性后,接种于Marc-145细胞,经过6代盲传,发现典型的细胞病理变化(CPE),经鉴定为PRRSV,命名为GXA株,其毒价为105.33TCID50/mL。参考VR-2332和CH-1a株基因序列,设计了3对特异性引物,分别对GXA株的E、M、N基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。应用DNAstar生物学软件拼接得到GXA株的E、M和N3个基因片段共长为1473bp。同源性分析表明,GXA株与VR-2332、MLV和BJ-4的同源性为99.7%～100%,而与欧洲型代表株LV的同源性只有66.4%。表明GXA与VR-2332、MLV及BJ-4株亲缘关系比较密切,与欧洲型代表株LV亲缘关系最远,属于美洲型毒株,有可能来源于疫苗株。

摘要：基于大肠杆菌原核表达的G重组蛋白缺少糖基化修饰,诱导机体产生中和抗体的能力较弱。为制备G蛋白多克隆抗体,针对G蛋白抗原Ⅳ区第251位氨基酸的中和抗原表位,以日本RABV疫苗株RC-HL的G蛋白序列为模板,设计了含有17个氨基酸的多肽序列MQTSDETKWCPPDQLVN(G17),合成后偶联KLH蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠,采集血液分离血清获得抗G蛋白多克隆抗体。实验显示,制备的多克隆抗体效价在1∶500以上,在1∶200的稀释度下,可以对原核表达的G重组蛋白、真核表达的G重组蛋白进行Western Blot检测。基于狂犬病病毒G蛋白抗原位点Ⅳ区制备获得的抗G蛋白多克隆抗体具有反应性好及特异性强的特点,能够用于检测G重组蛋白,为进一步研究G蛋白功能、研发单抗和设计疫苗打下良好基础。

摘要：根据GenBank中猪肺炎支原体(Mhp)J株P36蛋白基因(登录号X67286)的核苷酸序列设计1对引物,建立了快速检测Mhp的PCR方法。该方法能扩增出948bp的Mhp特异性条带,其敏感性达到可检测出0.735ng的Mhp DNA,但对鸡毒支原体、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒均未检测出相应目的条带;将克隆获得的目的片段与GenBank已发表的Mhp J株的P36基因进行比较,同源性达到99.9%。采用所建立的PCR方法对42份疑似猪支原体肺炎(MPS)病料进行临床诊断,发现有13份呈阳性(31.0%)。可见,该PCR方法适合于MPS的临床诊断,可为其防控提供可靠依据。